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Bibliographic Metadata

Title
JNK- und PKC-abhängige Regulation von p66Shc
AuthorKhalid, Sana
CensorBaier, Gottfried ; Doppler, Wolfgang
Thesis advisorTroppmair, Jakob
Published2016
Institutional NoteInnsbruck, Univ., Diss., 2016
Annotation
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Date of SubmissionFebruary 2016
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)p66Shc / PKC / Reaktive Sauerstoffspezies / Oxidativer Stress / Zelltod / Signalwege
Keywords (EN)p66Shc / PKC / Reactive Oxygen species / Oxidative Stress / Cell death / Signaling
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-4381 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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JNK- und PKC-abhängige Regulation von p66Shc [7.96 mb]
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Abstract (German)

Während der Transplantation von soliden Organen werden viele pathologische Veränderungen, die in Summe im Ischämie/Reperfusions-Schaden enden, durch p66Shc-produzierte reaktive Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufen. Die gezielte Inhibierung von p66Shc könnte daher einen neuen therapeutischen Ansatz zur Vermeidung von oxidativen Schäden darstellen. Dieser Effekt konnte bisher durch den Einsatz von Antioxidantien in vivo nur sehr eingeschränkt erreicht werden. Vorangegangene Publikationen konnten zeigen, dass die pro-oxidative und pro-apoptotische Funktion von p66Shc eine Phosphorylierung an Serin 36 (S36) und den darauffolgenden Transport in die Mitochondrien erfordert. Ursprünglich wurde PKC als S36-Kinase identifiziert, aber auch c-Jun N-terminale Kinasen (JNKs) könnten für eine Phosphorylierung dieser Gruppe, mit unklaren Auswirkungen auf ROS-Produktion und Zelltod, verantwortlich sein. Um die frühen Auswirkungen von Ischämie/Reperfusion (IR) zu simulieren, wurde von uns entweder H2O2-Behandlung oder Hypoxie/Reoxigenierung (HR) eingesetzt. Während der Reperfusion konnten wir in vivo erhöhte Aktivität von Stresskinasen (JNK, p38) und signifikant gesteigerte p66ShcS36 Phosphorylierung, sowie ROS Freisetzung und Zellschädigung in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) und HL-1 Kardiomyocyten feststellen. Der Einsatz von JNK1/2 und p38-spezifischen niedermolekularen Inhibitoren bewirkte eine verringerte p66ShcS36 Phosphorylierung nur bei JNK1/2-Hemmung. Darüber hinaus konnte S36-Phosphorylierung von rekombinantem p66Shc durch die Inkubation mit aufgereinigtem JNK1 beobachtet werden, jedoch nicht mit PKC. Außerdem wurde die Stress-induzierte Bindung von JNK1/2 an p66Shc nachweisen. Durch den Einsatz von JNK1/2-defizienten MEFs konnten wir die JNK1/2-abhängige Regulierung der p66ShcS36-Phosphorylierung, der ROS-Produktion und des nachfolgenden Zelltods weiter bestätigen. Schließlich konnten die Defekt von JNK1/2 -/- MEFs in der Produktion von ROS durch die phosphomimetischen p66ShcS36E Mutante umgekehrt werden.

Obwohl unsere Experimente PKC nicht als S36-Kinase bestätigen konnten, wurde gezeigt, dass PKC für die ROS-Produktion erforderlich ist. Auf der Suche nach PKC-Phosphorylierungsstellen auf p66Shc wurde mittels massenspektrometrischer (MS) Analysen das regulatorische Serin 139 (S139) entdeckt. p66Shc-defiziente MEFs rekonstituiert mit einer p66Shc S139A-Mutante zeigten signifikant reduzierte mitochondriale ROS-Werte und verringerten Zelltod. Folglich gehen wir von einem Modell aus, bei dem PKC und JNK1/2 gemeinsam für die p66Shc Aktivierung verantwortlich sind. Daher könnte die selektive Inhibierung der JNK1/2 oder PKC-regulierten p66Shc-Aktivierung einen therapeutischen Ansatz zur Verringerung von Zellschäden bei oxidativem Stress darstellen

Abstract (English)

p66Shc-produced ROS contribute to many pathologies including ischemia/reperfusion injury (IRI) during solid organ transplantation. Inhibiting p66Shc activation may offer a novel therapeutic approach toward the prevention of oxidative damage, which is poorly managed by antioxidants in vivo. Published work suggests that pro-oxidant and pro-apoptotic function of p66Shc requires mitochondrial import, which depends on serine 36 (S36) phosphorylation. PKC was initially identified as S36 kinase but c-Jun N-terminal kinases (JNKs) may also phosphorylate this residue, with unclear consequences for ROS production and cell death. To simulate the early stages of ischemia/reperfusion (IR) we either used H2O2 treatment or hypoxia/reoxygenation (HR). As during reperfusion in vivo, we observed increased stress kinase (JNK, p38) activity in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and HL-1 cardiomyocytes along with significantly increased p66ShcS36 phosphorylation, ROS production and cell damage. Application of JNK1/2 and p38-specific small molecular weight inhibitors caused a pronounced decrease in p66ShcS36 phosphorylation only in the absence of JNK1/2 activation. Moreover, S36 phosphorylation of recombinant p66Shc was seen following incubation with purified JNK1 but not PKC. Additionally, stress-induced binding of JNK1/2 to p66Shc was observed. We further confirmed JNK1/2-dependent regulation of p66ShcS36 phosphorylation, ROS production and cell death using JNK1/2-deficient MEFs. Finally, the low ROS phenotype of JNK1/2 -/- MEFs was reversed by the phosphomimetic p66ShcS36E mutant.

While our experiments failed to establish PKC as S36 kinase, but could confirm the requirement of PKC for ROS regulation under the conditions studied here. In the search for the PKC phosphorylation sites in p66Shc mass spectrometric (MS) analysis revealed S139 as PKC regulatory site. p66Shc-deficient MEFs reconstituted with the S139A mutant of p66Shc showed significantly reduced mitochondrial ROS levels and cell death. We thus propose a model, where PKC and JNK1/2 are jointly required for p66Shc activation. Selectively inhibiting JNK1/2 or PKC-regulated p66Shc activation may thus provide a therapeutic approach for decreasing damage to cells under conditions of oxidative stress.

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