Titelaufnahme

Titel
Protein networks associated with Group 1 metabotropic Glutamate receptors: relevance for trafficking and signaling
VerfasserMANSOURI, MAHNAZ
Begutachter / BegutachterinEnz, Klimaschewski, Ralf, Lars
Betreuer / BetreuerinFerraguti, Francesco
Erschienen2015
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeDezember 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)mGlu der Gruppe 1 / Freeze-fracture Replica Immunogold Labelling / Co-Immunopräzipitation / Flüssigchromatographie Tandem Massenspektrometrie / KCTD12
Schlagwörter (EN)Group 1 mGlu receptors / Freeze-fracture Replica Immunogold Labelling / Co-immunoprecipitation / Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry / KCTD12
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-4306 Persistent Identifier (URN)
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Protein networks associated with Group 1 metabotropic Glutamate receptors: relevance for trafficking and signaling [16.48 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Metabotrope Glutamatrezeptoren (mGlu) der Gruppe I (mGlu1 und mGlu5) spielen eine bedeutende Rolle in synaptischer Signalübertragung und neuronaler Plastizität verschiedener Hirnregionen. In der Kleinhirnrinde (Cortex cerebelli) sind mGlu1 Rezeptoren essentiell für die Ausbildung der Langzeit-Depression (LTD). Im Hippocampus sind mGlu5 Rezeptoren sowohl an der Ausbildung der LTD sowie bei der Langzeit-Potenzierung (LTP) beteiligt. Gruppe 1 mGlu weisen eine gesonderte subzelluläre Lokalisierung auf, deren molekularen Grundlagen weitgehend unbekannt sind. Zusätzlich sind zwar die intrazellulären Signaltransduktions-Wege der mGlu Rezeptoren bekannt, aber bis jetzt ist noch unklar wie sie ihre Funktion genau erfüllen und welchen Regulierungen sie unterworfen sind.

In dieser Arbeit wurde die subzelluläre Lokalisierung des mGlu1 Rezeptors mit Hilfe der Freeze-fracture Replica Immunogold Labelling (FRIL) Methode untersucht. Zusätzlich wurde ermittelt ob Long-Homer Proteine die subsynaptische Lokalisierung des Rezeptors im Kleinhirn regulieren. Wir konnten bestätigen, dass mGlu1 Rezeptoren vermehrt im perisynaptischen Bereich glutamaterger Synapsen auftreten. Außerdem konnten wir zeigen das mGlu1 in GABAergen Synapsen keine perisynaptische Verteilung aufweist, und stattdessen im Hauptkörper der Synapse vorliegt. Um zu erforschen, ob Long-Homer Proteine eine tragende Rolle in der perisynaptischen mGlu1 Verteilung (in glutamatergen Synapsen) spielen, unterbrachen wir die mGlu1-Homer Interaktion mit Hilfe des membrangängigen dominant-negativen TAT-Homer1a Proteins. In der nachfolgenden FRIL Analyse konnte jedoch keine Veränderung in der Lokalisierung der mGlu1 Rezeptoren festgestellt werden. Dies bedeutet, dass nicht Long-Homer sondern andere, noch unbekannte Scaffolding-Proteine für diese spezielle perisynaptische Lokalisierung verantwortlich sind.

Um diese anderen, potentiellen Interaktionspartner zu identifizieren, führten wir eine Co-Immunopräzipitation (Co-IP) mit nachgeschalteter Flüssigchromatographie Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS) durch. Diese Co-IP für mGlu1 Rezeporen wurde mit hoch-spezifischen Antikörpern in einem Kleinhirn-Homogenat (Maus) bewerkstelligt. Die LC-MS/MS Analyse des Eluats ergab die Identifizierung von sowohl bekannten als auch neuen, unbekannten Interaktionspartnern. Einer der neuen Interaktionspartner ist KCDT12. Dieser wurde auch mit Co-IPs für mGlu5 aus Hippocampus-Homogenaten (Maus) identifiziert, und scheint somit ein gemeinsamer Interaktionspartner für mGlu Rezeptoren der Gruppe 1 zu sein. Um die Interaktion zwischen mGlu1 und KCDT12 zu sichern wurde eine reverse Co-IP (KCDT12 Antikörper) durchgeführt, die mGlu1 als potentiellen Interaktionspartner von KCDT12 bestätigte. Daraufhin folgten Co-Lokalisierungsstudien mit der FRIL Methode um zu ermitteln, ob die beiden Proteine direkt oder indirekt miteinander interagieren. Wir konnten nachweisen, dass KCDT12 und mGlu1 sich in der selben Nano-Domain in Kleinhirn Purkinje-Zellen befinden. Allerdings wurden sie in einer Distanz zueinander beobachtet, die eine indirekte Interaktion wahrscheinlicher erscheinen ließ. Diese Beobachtung konnte durch zusätzliche Experimente mit einer rekombinanten Zelllinie die KCDT12 und mGlu1 ko-exprimierte bestätigt werden, da in diesem Fall eine Co-IP nicht zu einer Detektion des mGlu1 Rezeptors führte. Ein potentieller Zwischen-Interaktionspartner, der GABAB Rezeptor, konnte durch Co-IP Versuche in Kleinhirn-Homogenaten von GABAB Rezeptor Knock-out Mäusen ausgeschlossen werden.

Zusammenfassend ergab diese Arbeit,

1. dass mGlu1 Rezeptoren eine komplexe subsynaptische Organisation in Kleinhirn Purkinje-Zellen aufweisen.

2. die Identifizierung von Gewebe-spezifischen Protein-Komplexen, die in einer Interaktion mit mGlu Rezeptoren der Gruppe 1 stehen und möglicherweise funktionell in die Regulierung des mGlu Rezeptor-Transports und/oder der mGlu Signaltransduktion involviert sind.

3. dass der neu-identifizierte Interaktionspartner KCDT12 ein funktionell relevantes Interaktionsprotein im Signalkomplex von Gruppe 1 mGlu Rezeptoren ist da KCDT12 in der selben Nanodomain nachgewiesen wurde. Allerdings konnte das Protein, dass die Interaktion zwischen mGlu und KCDT12 vermittelt noch nicht identifiziert werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Group I metabotropic Glutamate (mGlu) receptors play a pivotal role in synaptic transmission and neuronal plasticity in different brain areas. In particular, the mGlu1 receptor is critically involved in Long-Term Depression (LTD) in the cerebellar cortex, whereas the mGlu5 receptor is involved in both Long-Term Potentiation and LTD in the hippocampus. Group I mGlu receptors are complementary distributed in the central nervous system with a highly discrete subcellular localization. However, the molecular mechanisms involved in the regulation of their subcellular trafficking remain largely unknown. Moreover, despite these receptors can activate a variety of intracellular transduction pathways, their functional integration and regulation are poorly understood.

This study investigated by means of the Freeze-fracture Replica Immunogold Labelling (FRIL) method the subcellular localization of mGlu1 receptor in the rodent cerebellum and whether Long-Homer proteins regulate the subsynaptic distribution of this receptor. We confirmed the perisynaptic enrichment of mGlu1 at glutamatergic synapses and demonstrated its localization within the main body of GABAergic synapses. To test whether Long-Homer proteins play a critical role in the perijunctional localization of mGlu1 receptor at glutamatergic synapses, we disrupted the mGlu1-Homer association using the membrane permeable dominant-negative TAT-Homer1a. FRIL analysis showed, however, no significant alteration in the mGlu1 receptor distribution pattern at Parallel Fiber-Purkinje cell synapses, suggesting that other scaffolding proteins are involved in this perisynaptic confinement.

To identify novel Group I mGlu receptor-associated protein complexes, we used an unbiased tissue-specific proteomic approach, namely Co-immunoprecipitation (Co-IP) followed by Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) analysis. Co-IP of mGlu1 receptor was performed from mouse cerebellar homogenates using highly specific polyclonal antibodies. LC-MS/MS analysis of the eluates identified a large number of well-known as well as novel interactors. A novel putative interaction partner, namely KCTD12, was identified in all LC-MS/MS analyses. KCTD12 was also detected in Co-IP of mGlu5 receptor from mouse hippocampal homogenates, suggesting that this protein is a common interaction partners of Group I mGlu receptors. Of note, reverse Co-IP from mouse cerebellum revealed mGlu1 receptor in the WT but not in KCTD12-Knock Out eluates. In order to elucidate the nature of the interaction (direct or indirect) between the mGlu1 receptor and KCTD12, we performed co-localization studies using the FRIL method. We could show that KCTD12 and mGlu1 are present in the same nano-domain in Purkinje cell spines, although at a distance that would indicate an indirect interaction. Consistent with this, the mGlu1 receptor could not be Co-IP from protein extracts obtained from a recombinant mammalian cell line co-expressing the two proteins. The possibility that this interaction was mediated via GABAB receptor was excluded by performing Co-IP experiments on cerebellar homogenates obtained from GABAB receptor-null mice.

In conclusion, this study reveals a complex subsynaptic organization of mGlu1 receptor in cerebellar Purkinje cells, and identifies tissue specific protein clusters associated to Group I mGlu receptors that could be involved in the regulation of the trafficking and signaling of these receptors. Among the novel putative interactors, KCTD12 appears as a functionally relevant auxiliary protein of Group I mGlu receptor signaling complexes in neurons, as they coexist in the same nano-domain. On the other hand, this interaction is probably mediated by yet unknown protein intermediates.