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Titel
Functional impact of human disease mutations, protein-protein and lipid-protein interactions on L-type Ca2+ [Ca hoch 2+] channels / Alexandra Pinggera
VerfasserPinggera, Alexandra
GutachterStriessnig, Jörg
Erschienen2015
UmfangIX, 162 S. : zahlr. Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Datum der AbgabeDezember 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Spannungsabhängige Calciumkanäle / Cav1.2 / Cav1.3 / Mutationen / Autismus Spektrum Störung / Aldosteronproduzierende Adenome / Modulation durch Protein-Protein Interaktionen / Modulation durch Plasmamembranphospholipide
Schlagwörter (EN)voltage gated calcium channels / Cav1.2 / Cav1.3 / mutations / autism spectrum disorder / aldosterone producing adenomas / modulation by protein-protein interactions / modulation by plasma membrane phospholipids
Schlagwörter (GND)Autismus / Calciumkanal / Spannungskontrollierter Ionenkanal / Mutation
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-3567 Persistent Identifier (URN)
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Functional impact of human disease mutations, protein-protein and lipid-protein interactions on L-type Ca2+ [Ca hoch 2+] channels [5.49 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Spannungsabhängige L-Typ-Ca2+ Kanäle (LTCK) übersetzen Membrandepolarisationen in unterschiedliche zelluläre Funktionen wie Muskelkontraktion, Genregulation, Neurotransmitterfreisetzung und Hormonausschüttung. In Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich die Krankheitsrelevanz von menschlichen LTCK-Mutationen als auch die Modulation dieser Kanäle durch Plasmamembranlipide und Proteininteraktionen untersucht. Kürzlich wurden mehrere Cav1.3-Mutationen in Probanden mit Autismus-Spektrum-Störungen (ASD) als auch in Aldosteron produzierenden Adenomen (APA) identifiziert. Des Weiteren wurde eine zusätzliche Cav1.3 Mutation in einer Familie mit kardialen und neurologischen Dysfunktionen (KND) identifiziert. Um einen Einblick in das krankheitsfördernde Potential dieser Mutationen zu bekommen, wurden sie nach rekombinanter Expression in tsA-Zellen mittels whole-cell Patch-Clamp Experimenten auf mögliche Veränderungen ihrer biophysikalischen Eigenschaften untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die in ASD-Personen identifizieren de novo Mutationen G407R (IS6) und A749G (IIS6), zu einem komplexen Phänotyp führen, der sowohl Merkmale einer erhöhten, als auch einer verringerten Funktion aufweist. Dies deutet darauf hin, dass die Mutationen in diesen Probanden in der Tat eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von ASD spielen. Ähnlich zu den bereits charakterisierten Cav1.3 APA-Mutationen, resultierten auch die hier untersuchten Mutationen (F747L, IIS6; R990H, IIIS4; M1354I, IVS5), zu Veränderungen im Öffnungs- und Schließverhalten (Gating) des Kanals, welche einen erhöhten Ca2+ Einstrom in die Zelle zur Folge haben und damit zur erhöhten Aldosteronproduktion führen. Die in KND identifizierte Cav1.3 Mutation führte im Gegensatz dazu nur zu geringen Gatingveränderungen in der C-terminalen kurzen Spleißvariante des Cav1.3 Kanals. Daher ist es sehr unwahrscheinlich, dass diese Mutation eine kausale Rolle in der Entwicklung von KND spielt. Abgesehen von Mutationen, können allerdings auch andere Mechanismen das Gating von LTCKs ändern. Die I-II-Linker aller LTCKs enthalten ein positiv geladenes Motiv, bestehend aus vier Arginin Resten. Live-cell imaging Experimente zeigten, dass dieses Motiv mit negativ geladenen Phospholipiden der Plasmamembran interagiert. Elektrophysiologische Experimente zeigten zudem, dass das positiv geladene Motiv die Kanalaktivität moduliert indem es dessen Öffnungswahrscheinlichkeit reduziert und die Hemmung des Kanals durch Hydrolyse von Plasmamembranphospholipiden meditiert. Dies zeigt, dass dieses Motiv nicht nur einen zurückhaltenden Gating-Modus stabilisiert, sondern auch die Modulation der Kanalaktivität durch rezeptorvermittelten Lipidabbau mediert. Zudem hab ich im Rahmen meiner Dissertation untersucht, ob die Interaktion der präsynaptischen Proteine RIM2 und RIM-binding-protein 2 (RBP2) mit Cav1.3 für dessen langsame spannungsabhängige Inaktivierung in den inneren Haarzellen (IHZ) der Cochlea verantwortlich ist. Mittels nested PCR konnte ich die Expression von RIM2- und RBP2-Transkripten in Maus-IHZ in allen Entwicklungsstadien zeigen. Co-Lokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie nach rekombinanter Expression in tsA-Zellen als auch Co-Immunpräzipitationen von Mausgeweben, sprechen gegen eine stabile Interaktion von RBP2 mit RIM2 und Cav1.3. In elektrophysiologischen Experimenten konnte jedoch gezeigt werden, dass die Co-Expression von RBP2 und/oder RIM2 in tsA-201-Zellen, die spannungsabhängige Inaktivierung des Kanals signifikant verringert, allerdings nicht im selben Ausmaß wie in IHZ. Daher bedarf es weiterer Experimente um die Ursache für die langsame spannungsabhängige Inaktivierung in IHZ herauszufinden.

Zusammenfassung (Englisch)

Voltage gated L-type Ca2+ channels (LTCCs) transduce membrane depolarization into different cellular functions like muscle contraction, gene regulation, neurotransmitter release and hormone secretion. In my thesis, I investigated the disease relevance of human LTCC mutations and the modulation of these channels by plasma membrane lipids and protein interactions. Recently, several mutations have been identified in Cav1.3 in probands with autism spectrum disorders (ASD) as well as in aldosterone producing adenomas (APAs). An additional Cav1.3 mutation was identified in a family with cardiac and neurological disorders (CND). I investigated the biophysical alterations induced by these mutations upon heterologous expression in tsA-201 cells using whole-cell patch-clamp recordings, in order to assess their disease causing potential. I found that de novo mutations G407R (IS6) and A749G (IIS6), both identified in individuals with ASD, resulted in a complex phenotype with features of gain- as well as loss-of-function. This suggests that they play an important role in the pathophysiology of ASD in these probands. Moreover, similarly to what has already been reported for Cav1.3 mutations identified in other APAs, the mutations characterized here (F747L, IIS6; R990H, IIIS4; M1354I, IVS5) resulted in gating changes enabling enhanced Ca2+ influx, underlying the increased aldosterone production. In contrast, the Cav1.3 mutation identified in CND resulted in minor gating changes only when introduced in a C-terminal short Cav1.3 splice variant (Cav1.3S), making a causative role very unlikely. Apart from mutations, other mechanisms can also modify LTCC gating. The I-II linker of all LTCCs contain a polybasic motif comprising four arginine residues. Live-cell imaging experiments showed that this motif interacts with negatively charged phospholipids of the plasma membrane. Electrophysiological experiments revealed that the polybasic motif modulates the channel activity by reducing the open probability and by mediating current inhibition upon hydrolysis of plasma membrane phospholipids. This indicates that the polybasic motif not only stabilizes a more reluctant gating mode but also supports modulation of channel activity by receptor-mediated lipid breakdown. In my thesis I also investigated if interaction of the presynaptic proteins RIM2 and RIM-binding-protein 2 (RBP2) could account for the slow voltage dependent inactivation (VDI) observed in cochlear inner hair cells (IHCs). Nested PCR revealed expression of RIM2 and RBP2 transcripts in mouse IHCs at all developmental stages. Co-localization studies using immunofluorescence microscopy upon recombinant expression in tsA-cells as well as co-immunoprecipitations from mouse tissue, argued against a stable interaction of these proteins. However, electrophysiological experiments revealed that co-expression of RBP2 and/or RIM2 in tsA-201 cells significantly reduced the VDI of the channel, but not to the same extend as observed in IHCs. The mechanism responsible for the slow VDI in these cells therefore needs further investigation.