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Title
Über den Chlorophyll-Abbau in "Arabidopsis thaliana" / vorgelegt von Iris Süssenbacher
AuthorSüssenbacher, Iris
CensorKräutler, Bernhard ; Hörtensteiner, Stefan
Thesis advisorKräutler, Bernhard ; Müller, Thomas
Published2015
Description170 S. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Annotation
Zsfassung in engl. Sprache
Date of SubmissionDecember 2015
LanguageGerman
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Chlorophyll / Metabolismus / Phyllobiline / Tetrapyrrole / Strukturaufklärung
Keywords (GND)Ackerschmalwand / Chlorophyll / Abbauprodukt
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Abstract (German)

NCCs (non-fluorescent Chl catabolites), die auch als Typ-I Phyllobiline bezeichnet werden, stellen in den gelben Blättern der meisten Pflanzen die Hauptabbauprodukte des Chlorophylls (Chl) dar. Vor kurzem konnten jedoch in Blättern von Spitzahorn und Gerste DNCCs (1,19-Dioxobilin-type NCCs), die auch als Typ-II Phyllobiline bezeichnet werden, als Chl-Abbauprodukte und zweiter Abbauweg identifiziert werden.

In Arabidopsis thaliana (A. thaliana) wird eine große Vielfalt an verschiedenen Phyllobilinen, sowohl Typ-I als auch Typ-II, gebildet. In HPLC-Analysen von Extrakten seneszenter Blätter des Wildtypus, die für sechs Tage in Dunkelheit inkubiert wurden, wurden neben den bekannten NCCs, nun auch fünf NDCCs (non-fluorescent 1,19-dioxobilin-type Chl catabolites) anhand ihrer charakteristischen UV/Vis-Absorptionen detektiert. Durch Isolation, sowie spektrometrischer als auch spektroskopischer Analysen, wurden die Strukturen dieser NDCCs aufgeklärt. Alle isolierten Typ-II Phyllobiline des Wildtypus zeichnen sich durch eine freie C82-Carbonsäurefunktion, sowie durch die Abwesenheit der für Typ-I Phyllobiline charakteristischen -Fromylgruppe am Ring A aus. Drei dieser NDCCs (At-DNCC-33, At-DNCC-45 und At-DNCC-48) wurden als „typische“ DNCCs, wie aus Ahorn und Gerste bekannt, identifiziert. Die beiden anderen NDCCs weisen eine zusätzliche, erstaunliche Hydroxymethylgruppe am Ring A entweder an der C4- oder C2-Position auf und wurden dementsprechend als At-4HM-DNCC-41 und At-2HM-iso-DNCC-43 bezeichnet. Diese neuartige, erstaunliche Modifikation wurde bisher weder in anderen Chl-Kataboliten noch in Häm-Abbauprodukten beobachtet.

In früheren in vitro Experimenten wurde schon gezeigt, dass der epi-pFCC (epi-primary fluorescent Chl catabolite) durch oxidative Deformylierung, die durch die CYP89A9 (eine Cytochrom P450 Monooxygenase) katalysiert wird, in vier epi-pDFCCs (epi-primary 1,19-dioxobilin-type fluorescent Chl catabolites) umgewandelt wird. Ein Paar dieser epi-pDFCCs isomerisierten anschließend unter leicht sauren Bedingungen (pH 5) zu einem Paar DNCCs.

In den Extrakten von Blättern des Wildtypus, die sich in einem frühen Seneszenzstadium befanden, wurde nun eine neuartige, fluoreszierende Fraktion anhand ihres charakteristischen UV/Vis-Spektrums als FDCC (fluorescent DCC) klassifiziert. Spektrometrische und spektroskopische Analysen offenbarten für diese fluoreszierende Verbindung die Struktur eines „echten“ DFCCs, weshalb dieser als At-DFCC-33 bezeichnet wurde. Im sauren Milieu bei pH 5 isomerisiert dieser At-DFCC-33 schnell und stereo-selektiv zu einem DNCC, der als At-DNCC-33 identifiziert wurde, und stellt somit dessen Vorläufer in vivo dar. Das Isomerisierungsexperiment und die Charakterisierung des natürlich vorkommenden At-DFCC-33 sowie die in vitro Experimente bestätigen die Rolle der DFCCs als Vorläufer und Eintrittspunkt zu den nicht-fluoreszierenden Typ-II Phyllobilinen im Chl-Abbau in A. thaliana.

Neben dem Wildtypus wurden auch einige Mutanten von A. thaliana, wie etwa die mes16-1 und cyp89a9-1, untersucht.

MES16 ist eine Methylesterase in A. thaliana, die die Hydrolyse des C82-Carbonsäuremethylesters von fluoreszierenden Chl-Kataboliten, wie etwa pFCCs und DFCCs, katalysiert. In HPLC-Analysen von Extrakten seneszenter Blätter der mes16-1 Mutante wurden sowohl Typ-I als auch Typ-II Phyllobiline aufgrund ihrer charakteristischen Absorptionseigenschaften detektiert. Wie schon im Wildtypus beobachtet, stellen DCCs auch in dieser Mutante die Hauptabbauprodukte dar, die aber im Vergleich jenen aus dem Wildtypus eine intakte C82-Carbonsäuremethylesterfunktion aufweisen. Aus Extrakten der für vier Tage in Dunkelheit inkubierten Blätter wurden vier NDCCs und ein FDCC isoliert. Unter diesen befanden sich zwei typische DNCCs, At-mes16-DNCC-38 und At-mes16-DNCC-47. Auch in der mes16-1 Mutante wurden zwei NDCCs beobachtet, die eine zusätzliche Hydroxymethylgruppe am Ring A tragen und basierend auf der Position der Hydroxymethylgruppe als At-mes16-4HM-DNCC-44 bzw. At-mes16-2HM-iso-DNCC-46 bezeichnet wurden. Die Charakterisierung des FDCCs ergab, dass auch dieser die neuartige und rätselhafte Hydroxymethylgruppe am Ring A aufweist. Durch Auswertung der Korrelation der 1D- und 2D-NMR-Spektren wurde diese Hydroxymethylgruppe der C2-Position zugeordnet und dieser daraus resultierend als At-mes16-2HM-iso-DFCC-48 bezeichnet.

CYP89A9 ist eine Cytochrom P450 Monooxygenase, die für die Bildung der DCCs durch die oxidative Deformylierung der pFCCs bzw. 32-OH-pFCCs verantwortlich ist. Die cyp89a9-1 ist eine Mutante, in der diese CYP89A9 Aktivität ausgeschaltet wurde. HPLC-Analysen von Extrakten seneszenter Blätter zeigten, dass die cyp89a9-1 Mutante immer noch in der Lage ist, Chl abzubauen. Jedoch konnten nur Typ-I und keinerlei Typ-II Phyllobiline detektiert werden, wobei NCCs die Hauptabbauprodukte darstellen. In den Extrakten wurden die fünf hauptsächlich gebildeten NCCs isoliert sowie spektrometrisch als auch spektroskopisch untersucht. Die NCCs dieser Mutante konnten den bekannten NCCs aus dem Wildtypus zugeordnet werden.