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Titelaufnahme

Titel
A1/Bfl1/Bcl2A1 function in leukocyte development and tumorigenesis / by Maja Anna Sochalska
Weitere Titel
BCL2-related protein A1 function in leukocyte development and tumorigenesis
VerfasserSochalska, Maja Anna
Begutachter / BegutachterinBrunner, Thomas ; Stoitzner, Patrizia ; Kleiter, Natascha
Betreuer / BetreuerinVillunger, Andreas
Erschienen2015
Umfanggetr. Zählung : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Enth. u.a. 5 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2014 - 2015 . - Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeOktober 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Bcl2 Familie / Bcl2A1 / A1 / BFL-1 / B Zellen / BCR / Leukämie / Apoptose / Lymphozyten / shRNA / RNAi
Schlagwörter (EN)Bcl2 family / Bcl2A1 / A1 / BFL-1 / B lymphocytes / BCR / lymphoma / leukemia / apoptosis / shRNA / RNAi
Schlagwörter (GND)Tumorimmunologie / Leukozyt / Bcl-2-Proteinfamilie / Hämatopoese
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-3012 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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A1/Bfl1/Bcl2A1 function in leukocyte development and tumorigenesis [3.7 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

programmierte Zelltod spielt eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im Immunsystem. Je nach ihrer Funktion kontrollieren dabei Proteine der Bcl2-Familie Apoptose durch Schutz oder durch Durchbrechen mitochrondrialer Membranintegrität. Letzteres führt zum Freisetzen von Cytochrom C ins Zytoplasma was wiederum Caspasen aktiviert und Zelltod einleitet. Defekte in Bcl2-reguliertem Zelltod können die Selektionsprozesse von Lymphozyten massiv beeinträchtigen, was zu Immundefizienz, Autoimmunität oder onkogener Transformation beitragen kann.

A1, auch Bcl2a1 im murinen bzw. BFL1 im humanen System genannt, ist eines der am wenigsten verstandenen anti-apoptotischen Mitglieder der Bcl2-Familie. Dies liegt v.a. daran, dass es durch seine genomische Struktur, mit drei proteinkodierenden Genen für A1 (A1a, A1b und A1d) sowie einem Pseudogen (A1c) in der Maus, nur schwer durch klassische Gen-Deletionsstudien im Tiermodel zu untersuchen ist. Basierend auf mRNA-Expressionsdaten und Überexpressionsstudien geht man jedoch davon aus, dass A1 eine kritische Rolle bei der normalen Entwicklung von Lymphozyten und deren Überleben spielt.

In dieser Arbeit beschreibe ich die Charakterisierung eines Doxycyclin-induzierbaren transgenen Tiermodells, mit dessen Hilfe sich alle funktionellen A1-Paraloge gleichzeitig durch RNA-Interferenz (RNAi) ausschalten lassen. Dieses RNAi-System verwendet die endogenen Komponenten der miRNA/siRNA-vermittelten Genregulation und verringert so die Proteinexpression durch Destabilisierung der mRNA bzw. durch Inhibition der mRNA-Translation. In unserem Fall wurde dazu eine kurze shRNA (short hairpin RNA), gerichtet gegen eine in den A1a-, A1b- und A1d-Transkripten konservierte Region, unter Kontrolle eines Tetracyclin (Tet)-induzierbaren Promotors gebracht. Dies erlaubt den induzierbaren „knockdown“ aller A1-Transkripte nach Zugabe von Tetracyclin/Doxycyclin.

Mit Hilfe dieses induzierbaren Systems konnte ich zeigen, dass A1 eine wichtige Funktion für das Überleben von follikulären B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen hat. So zeigten B-Zellen der Milz eine erhöhte Apoptoserate nach Stimulation mit anti-IgM-, aber nicht nach Behandlung mit anti-CD40-Antikörpern. Darüber hinaus machte eine niedrige A1-Expression diese follikulären B-Zellen sensitiver gegenüber dem Zelltod nach Kreuzvernetzen des B-Zell-Rezeptors (BCR). In diesem Zusammenhang wiesen meine Experimente ferner darauf hin, dass A1 von gerade den Kinasen des BCR-Signalwegs aktiviert wird, die Überlebenssignale vermitteln, nämlich Syk und Btk. Die Inhibition dieser Kinasen führt zum Zelltod vermittelt durch das pro-apoptotische Protein Bim. Aufgrund dieser Beobachtungen postuliere ich, dass A1 unterhalb des BCR als Gegenspieler von Bim funktioniert und damit eine wesentliche Rolle bei der Regulation des Überlebens von reifen B-Zellen spielt.

Zusammenfassung (Englisch)

Programmed cell death plays an important role in maintaining homeostasis in the immune system. Bcl2 family proteins control mitochondrial apoptosis signaling by either promoting or preventing membrane integrity and cytochrome c release into the cytosol leading to caspase activation. Deregulation of lymphocyte selection processes by impairment of Bcl2-regulated cell death can cause immunodeficiency, autoimmunity or contribute to malignant transformation.

A1, which is also called Bcl2a1, or, in humans, BFL1, is the least studied pro-survival member of the Bcl2 family, as in mice three functional genes encoding A1 protein (A1a, A1b and A1d) and one pseudogene (A1c) can be found thereby precluding conventional loss of function studies. However, based on mRNA expression analysis and overexpression studies it is considered to be critical for normal lymphocyte development and survival.

This thesis describes the characterization of a doxycycline-inducible transgenic mouse model, which allows for the ablation all functional A1 paralogues present in mice by RNA interference (RNAi). The RNAi system exploits the endogenous pathways of post-transcriptional gene suppression by mRNA degradation or inhibition of target mRNA translation. A short hairpin (sh)RNA targeting conserved regions in A1-a, A1-b and A1-d mRNA transcripts was embedded in the micro-RNA30 backbone and placed under control of a Tetracycline (Tet)-regulated promoter for conditional gene silencing.

Using this system I was able to demonstrate that A1 is most critical for the maintenance of follicular (FO) B cells in secondary hematopoietic organs. Splenic B cells exhibited impaired survival upon anti-IgM but not anti-CD40 triggered stimulation. Moreover, A1 knockdown increased the sensitivity of FO B cells to BCR ligation-mediated killing ex vivo. Furthermore, we were able to define A1 as a downstream target of the key-kinases mediating B-cell receptor (BCR)-dependent survival signals, Syk and Btk. Thereby, we define A1 as a novel regulator of BCR-mediated B cell survival. Additionally, I could show that Bim (but not Puma, Noxa or Bad) is the dominant BH3-only pro-apoptotic protein responsible for executing cell death upon inhibition of Syk or Btk-signaling that is preceded by loss of A1 protein expression.