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Titelaufnahme

Titel
Interaktionen vom EHEC-Virulenzfaktor Shigatoxin 2 mit neutrophilen Granulozyten
VerfasserHatz, Caroline
Betreuer / BetreuerinOrth-Höller, Dorothea
ErschienenInnsbruck, Juli 2015
UmfangVI, 87 Blätter : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität Innsbruck, Masterarbeit, 2015
Anmerkung
Kurzfassung in deutscher und englischer Sprache
Datum der AbgabeJuli 2015
SpracheDeutsch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)EHEC / HUS / Shigatoxin / neutrophile Granulozyten
Schlagwörter (EN)EHEC / HUS / Shigatoxin / Neutrophils / Granulocytes
Schlagwörter (GND)EHEC / Verotoxine / Lipopolysaccharide / Neutrophiler Granulozyt / Durchflusscytometrie
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-2459 Persistent Identifier (URN)
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Interaktionen vom EHEC-Virulenzfaktor Shigatoxin 2 mit neutrophilen Granulozyten [2.13 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Infektionen mit Shigatoxin (Stx)-produzierenden enterohaemorrhagischen Escherichia coli (EHEC) sind die Hauptursache für hämolytisch urämisches Syndrom (HUS), das u. a. durch akutes Nierenversagen gekennzeichnet ist. Stx sind AB5 Exotoxine mit einer enzymatischen A-Untereinheit und einer Globotriaosylceramid (Gb3)-bindenden B-Untereinheit. Nachdem sich EHEC im Darm angesiedelt hat, wird Stx freigelassen und über den Blutkreislauf zu seinen Hauptzielorganen, der Niere und dem Gehirn, befördert. Der genaue Transport ist bislang unklar, wobei die Rolle von polymorphonuklearen neutrophilen Granulozyten (PMN) als Überträger bereits öfters angedeutet worden ist. Ziel dieser Masterarbeit ist es, die Interaktionen der neutrophilen Granulozyten mit Stx2 besser zu verstehen.

Dazu wurde anhand der MTS-Methode und der direkten Durchflusszytometrie die Vitalität bzw. die Anzahl apoptotischer Neutrophile bei Inkubation mit unterschiedlichen Stx2-Konzentrationen gemessen. Weiters wurde die Wirkung der Komplementproteine Faktor H (FH) und C3b auf die Stx2/ PMN-Interaktion anhand der MTS-Methode und mit ELISA überprüft. Da bei einer Aufreinigung von Stx eine geringe Lipopolysaccharid (LPS)-Verunreinigung nicht auszuschließen ist, wurde der Effekt von LPS auf neutrophile Granulozyten mit MTS-Reagenz untersucht. Ferner wurde die Plasmamembran mittels Antikörper im Durchflusszytometer auf das Vorkommen der Rezeptoren Gb3 und Toll-like Rezeptor-4 (TLR-4) analysiert und die Bindung bzw. Internalisierung vom Stx2 an/ in Neutrophilen anhand der konfokalen Live-Mikroskopie dargestellt.

Es konnte gezeigt werden, dass Stx2 keine zytotoxische Wirkung auf PMN hat und bei Exposition der Neutrophilen gegenüber Toxinkonzentrationen von 0,5 - 5 g/ ml für 22 h sogar deren Vitalität signifikant gesteigert wurde. Die Komplementproteine hatten keinen wesentlichen Effekt auf die Interaktion von Stx2 mit Neutrophilen und LPS erhöhte lediglich in höheren Konzentrationen (0,25 - 5 g/ ml) die Vitalität der PMN, nicht aber in geringen Mengen (5 - 100 ng/ ml) wie in der hier verwendeten Stx2-Präparation vorliegend. Laut der Antikörper-Bindung wurde die Abwesenheit von Gb3 sowie eine geringe Präsenz von TLR-4 auf Neutrophilenoberflächen dokumentiert. Mithilfe der Live-Mikroskopie konnte fluoreszierendes Stx2 innerhalb von neutrophilen Granulozyten, allerdings nicht an deren Plasmamembran, lokalisiert werden. Wie sich die detaillierten Mechanismen der Stx2-Bindung an Neutrophile abspielen und ob diese Bindung eine potentielle Therapiemöglichkeit darstellt, wird sich in zukünftigen Forschungen herausstellen.

Zusammenfassung (Englisch)

Infections with Shigatoxin (Stx)-producing enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are a primary cause of hemolytic uremic syndrome (HUS). HUS is the most common cause of acute renal failure in childhood with a mortality rate of 3 to 5 %. Stx are classical AB5-exotoxins, consisting of an enzymatic A subunit and a globotriaosylceramide (Gb3)-binding B subunit. After colonizing the gut, Stx is released and carried by the bloodstream to its main target organs, the kidneys and the brain. The exact mechanism of delivery remains unclear, although the role of polymorphonuclear leukocytes (PMN or neutrophile granulocytes) as transporters has been suggested.

The aim of this Master thesis is the better understanding of the interactions between neutrophil granulocytes and Stx2. For this end, the vitality and the apoptotic state of incubated PMN with various concentrations of Stx2 was measured, using the MTS-method or direct flow cytometry respectively. In addition, the impact of the complement proteins factor H (FH) and C3b on Stx2/ PMN-interaction was tested by means of MTS-method and ELISA. As lipopolysaccharid (LPS)-contamination cannot be excluded when purifying Stx, the effect of LPS on neutrophil granulocytes was assessed with the help of MTS-reagent. Furthermore, the expression of neutrophil receptors was analysed and the occurrence of Gb3 and toll-like receptor 4 (TLR4) was illustrated using direct flow cytometry. At last, the binding and/ or internalization of Stx2 on/ in neutrophils was analysed by Confocal Laser Scanning Microscopy.

It could be shown that Stx2 has no cytotoxic effect on PMNs and even improves their vitality significantly with toxin concentrations of 0,5 - 5 g/ ml at an incubation time of 22 h. The complement proteins don't seem to have any impact on the Stx2/ PMN-interaction. LPS increases the vitality of PMN only in high dosage (0,25 - 5 g/ ml), but not in low concentrations (5 - 100 ng/ ml) as present in this Stx2 - preparation. The absence of Gb3, along with a low expression of TLR4, could be found on the surface of neutrophils. By means of the confocal microscopy, Stx2 was surprisingly discovered within neutrophil granulocytes, but could not be located on their plasmamenbrane.

To identify the detailed mechanisms of Stx2 - binding on neutrophils, and to reveal if this particular binding could be of interest for therapy, further investigations have to be done.