Go to page
 

Bibliographic Metadata

Title
Investigating the role of CDH1/FZR1 in proliferation, differentiation and development / [Giridhar Shivalingaiah]
AuthorShivalingaiah, Giridhar
CensorDirk, Meyer ; Villunger, Andreas
Thesis advisorGeley, Stephan
Published2015
Description280 Bl. : 1 CD-ROM ; Ill., graph. Darst.
Institutional NoteInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2015
Date of SubmissionJuly 2015
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)APC/C
Keywords (EN)Fzr1 / G1-phase / Aur A, PLK1 / senescence / cell death / MAPK / ciliogenesis / Fzr1 - G1-phase - Aur A, PLK1 - senescence - cell death - MAPK - ciliogenesis
Keywords (GND)Mitose / Ubiquitin-Protein-Ligase / Cycline / Zilie / Signalkette
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-3058 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
Files
Investigating the role of CDH1/FZR1 in proliferation, differentiation and development [67.67 mb]Videos [46.73 mb]
Links
Reference
Classification
Abstract (German)

mitotische Ubiquitinligase ‚Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C)‘ wird durch mitotische Phosphorylierung aktiviert und benötigt CDC20, um Securin und die mitotischen Cycline polyubiquitylieren zu können. Nach der Degradation der Cycline fällt die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) ab und CDC20 wird durch CDH1/FZR1 ersetzt, um den APC/C während des Austritts aus der Mitose und der nächsten G1-Phase aktiv zu halten. Obwohl viele Proteine spezifisch während des Austritts aus der Mitose degradiert werden, ist FZR1 für den Abschluss der Mitose nicht notwendig. Es ist hingegen essentiell für die Ausbildung und Aufrechterhaltung der G1-Phase. Mangel an FZR1 verursacht eine Verkürzung der G1-Phase und verfrühten Eintritt in die S-phase, wodurch DNA-Schaden induziert wird.

Um die Rolle von FZR1 weiter zu untersuchen, etablierte und analysierte ich zwei Modellsysteme: genetische Deletion von FZR1 in der Maus und Morpholino-induzierte Depletion in Zebrafischen. Deletion von FZR1 in der Maus, unter Aussparung des extraembryonalen Gewebes, bewirkte eine schwere Entwicklungsverzögerung und die meisten Mäuse starben unmittelbar nach der Geburt. Deletion in Keratinozyten bewirkte einen Augendefekt, da die Mäuse mit offenen Augen geboren wurden. Ansonsten zeigte die Haut allerdings keine offensichtlichen Defekte. Primäre FZR1 defiziente Keratinozyten zeigten jedoch starke Proliferations- und Migrationsdefekte, die den embryonalen Augendefekt erklären können. Weiters zeigten die Keratinozyten in vitro einen Differenzierungsdefekt durch mangelnde Aktivierung der MAPK nach Zugabe von Ca2+.

In Zebrafischen wird zFZR1 erst nach der Midblastula-Transition (MBT) exprimiert, also erst, wenn eine G1-Phase physiologischerweise etabliert wird. Injektion von zwei unabhängigen gegen zFZR1 gerichtete Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden, bewirkte schwere Entwicklungsstörungen und Embryonen konnten sich nicht über das Segmentationsstadium hinaus entwickeln. Diese Embryonen waren kürzer, zeigten unregelmäßig Somiten, entwickelten kardiale und renale Defekte und zeigten starke Nekrosen im ZNS. Analyse der Proliferation in Zebrafischembryonen zeigte, dass Depletion von zFZR1 zu einer Reduktion der Proliferationsrate, einer Akkumulation der Zellen in der G1-Phase, sowie zu Zelltod führte. Diese Veränderungen waren mit DNA Schädigungen assoziiert, welche durch Behandlung der Embryonen mit einem CDK Inhibitor (Roscovitine) reduziert werden konnte. Neben diesen Veränderungen, die vermutlich zu einer Reduktion der Gesamtzellzahl führen, konnten Änderungen in Prozessen festgestellt werden, die durch Wnt, Hedgehog und Notch Signale reguliert werden. Die Beieinträchtigung dieser Signalwege liegt möglicherweise in einer quantitativen und qualitativen Verminderung der Cilien, die nach Depletion von zFZR1 beobachtet werden konnte.

Die Ausbildung primärer Zilien war auch in humanen RPE-1 FZR1-RNAi Zellen beeinträchtigt, was auf die Hyperaktivität zweier mitotischer Kinasen (PLK1 und AurA, die normalerweise von FZR1 degradiert werden) zurückgeführt werden konnte. FZR1 wird also zur Etablierung der G1-Phase und für die Ausbildung von Zilien benötigt und reguliert dadurch nicht nur die Proliferation sondern auch wichtige, von Zilien abhängige, Signaltransduktionswege.

Abstract (English)

The multisubunit ubiquitin ligase APC/C is activated by mitotic phosphorylation and requires CDC20 to target securin and mitotic cyclins for ubiquitin-dependent proteolysis. After anaphase, CDH1/FZR1 replaces CDC20 to keep the APC/C active during the exit from mitosis and the ensuing G1-phase. FZR1 is dispensible for mitosis but required for maintaining G1-phase. Loss of FZR1 function in cell lines causes premature entry into S-phase associated with increased pH2AX levels, p53 upregulation and impaired proliferation. By utilizing two vertebrate model systems (mouse, zebrafish), I have found that FZR1 plays an essential role in development. Epiblast-restricted deletion of FZR1 in mice caused severe developmental delay and most animals died within 1 week after birth. Depletion of FZR1 in basal keratinocytes resulted in an ‘eye open at birth phenotype without displaying any other obvious skin defects. Primary keratinocytes from these KO animals displayed proliferation and differentiation defects. In addition, FZR1 KO keratinocytes showed loss of directed migration in ‘scratch assays and failed to differentiate upon Ca2+, which was associated with a lack of MAPK activation.

In the developing zebrafish, zFZR1 was expressed only after the mid-blastula transition, when G1-phase is established. Injection of two independent FZR1 morpholino antisense oligonucleotides delayed development beyond epiboly and arrested embryos in early segmentation stage. These morphant embryos were shorter, displayed irregular somites and developed cardiovascular as well as brain defects during later stages of development. Upon FZR1 depletion, cell proliferation was impaired. Embryos displayed high levels of the DNA damage marker pH2AX, which could be reduced by treating morphants with roscovitine, a CDK inhibitor. Analysis of developmental signaling in zebrafish morphants revealed abnormal planar cell polarity WNT, Hedgehog as well as Notch signaling. Interestingly, depletion of FZR1 impaired the formation of cilia, which are important organelles for developmental signaling, including those triggered by WNT and Hedgehog.

Human conditional FZR1 RNAi RPE1 cells also showed a strong reduction in ciliary length, suggesting that FZR1 is a critical regulator of ciliogenesis. The impairment of ciliogenesis was found to be due to PLK1 and Aurora kinase A, two substrates of FZR1-APC/C that are degraded during exit from mitosis. Persistence of these kinases in G1-phase antagonizes ciliogenesis by promoting cilia destabilization and resorption. Thus, FZR1 is not only required to establish G1-phase but, by controlling ciliogenesis, also for developmental signaling and, thus, differentiation.

Stats
The PDF-Document has been downloaded 62 times.