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Title
Functional characterization of Islet/Isl transcription factors in zebrafish pancreas formation / by Armin Wilfinger
AuthorWilfinger, Armin
CensorArgenton, Francesco ; Schwerte, Thorsten
Thesis advisorMeyer, Dirk
Published2015
Description114 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Date of SubmissionJuly 2015
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Islet1 / Islet2 / Lim homeodomain / Pankreas / Exokrin / Endokrin / Insulin / Glucagon / Zebrafisch
Keywords (EN)Islet1 / Islet2 / Lim homeodomain / Pancreas / Exocrine / Endocrine / Insulin / Glucagon / Zebrafisch
Keywords (GND)Zebrabärbling / Bauchspeicheldrüse / B-Zelle
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Abstract (German)

Der LIM homeobox Transkriptionsfaktor Islet1/Isl1 spielt eine wichtige Rolle in der Spezifizierung, Differenzierung, Proliferation sowie dem Überleben der endokrinen Zellen in der Bauchspeicheldrüse. Die in vielen Spezies konservierte Expression im sich entwickelnden sowie im fertig ausgebildeten Organ legt eine entsprechend konservierte Funktion nahe. Bisher wurden allerdings weder die Gründe für die Notwendigkeit in den endokrinen Zellen, noch der exakte molekulare Wirkungsmechanismus in einem anderen Modellorganismus als der Maus untersucht. In dieser Arbeit wird der Zebrafisch als Modell genutzt um durch eine Kombination von genetischen-, molekularen- und bildgebenden Verfahren die genaue Funktion von Isl1 in Wirbeltieren aufzuklären. In isl1 Zebrafischmutanten werden endokrine Zellen in normaler Anzahl angelegt, jedoch scheitern mehr als die Hälfte dieser Zellen an der Expression der endokrinen Hormone. Mithilfe eines ‘lineage tracking‘ Ansatzes konnte ich zeigen, dass die Funktion von Isl1 zelltyp-abhängig ist. Des Weiteren stellte ich fest, dass die Expression von isl1 im pankreatischen Mesenchym mit der von den beiden verwandten Genen islet2a/isl2a und islet2b/isl2b überlappt. Während isl1 Mutanten bereits eine Reduktion von exokrinem Gewebe aufweisen, führt die gemeinsame Blockade von zwei oder drei isl1/2 Genen zu einer gravierenderen, dosis-abhängigen Reduktion an exokrinem Pankreasgewebe. Ich habe eine Strategie für einen induzierbaren und zelltyp-spezifischen Knockout von isl1 im Zebrafisch entwickelt um dessen genaue Funktion aufzuklären. Die regulatorischen Elemente zur Expression von isl1 innerhalb der endokrinen Bauchspeicheldrüse sind bislang unbekannt. Deshalb nutzte ich ‚Bacterial artificial chromosomes‘ (BACs), welche das isl1 Gen sowie die potentiellen ‘Enhancer‘ enthalten, zur gezielten Expression eines DNA-Konstrukts in den Hormon produzierenden Zellen. Dieses System ermöglicht die Fluoreszenzmarkierung zum Tracking von Isl1 exprimierenden Zellen. Zusätzlich erlaubt eine Peptidfusion des Isl1 Proteins weitere biochemische Analysen. Schlussendlich dienen LoxP-Sequenzen, welche das zweite Exon flankieren, der zelltyp-spezifischen Ablation von Isl1. Zum besseren Verständnis der molekularen Isl1 Funktionen untersuchte ich die Expression von potentiellen Co-Faktoren. Mithilfe einer RT-qPCR basierten Analyse von embryonalen und adulten Pankreasproben ermittelte ich 12 Kandidatengene. RNA in-situ Hybridisierung zeigte die Expression von 5 dieser Gene im adulten, endokrinen Pankreas des Zebrafisches, während ein Gen ausschließlich im exokrinen Gewebe zu finden war. Die anschließende biochemische Analyse mittels Co-Immunopräzipitation ergab, dass mindestens zwei dieser Proteine (Lbd1a und Ldb1b) in vitro mit Isl1 interagieren.

Abstract (English)

Islet1/Isl1 is a LIM homeobox transcription factor with multiple functions during specification, maturation, proliferation and survival of various pancreatic cell types. While the conserved expression in the developing and mature vertebrate pancreas suggests a conserved function, neither the molecular basis for the diverse pancreatic requirements nor the developmental functions in a model other than the mouse had been addressed so far. Here, a combination of genetic, molecular and in vivo imaging approaches in the model organism zebrafish is used in order to address the function of Isl1 in vertebrates. In isl1 mutant fish, endocrine cells are specified in normal numbers but more than half of these cells fail to establish expression of endocrine hormones. By using a lineage tracking approach, I show that Isl1 functions are different depending on the cell type. In addition, I find that isl1 expression in the pancreatic mesenchyme overlaps with that of the related genes islet2a/isl2a and islet2b/isl2b. While isl1 mutants already display a reduction of exocrine tissue, a combined block of two or three isl1/2 genes results in a stronger, dose-dependent reduction of exocrine tissue. To address the late cell type specific transcriptional functions, I created a strategy for inducible, lineage specific knockout of isl1 in zebrafish. As the regulatory elements driving isl1 expression in the endocrine pancreas have not yet been found, I used a bacterial artificial chromosome (BAC) containing the isl1 gene and potentially the regulatory sequences for expression of a targeting construct in the hormone producing cells. This system would allow the fluorescent labeling and tracking of Isl1 expressing cells. In addition, adding a short peptide to the Isl1 protein can be used for subsequent biochemical analysis. Lastly, LoxP-sites flanking the second exon of the isl1 gene will serve for cell type specific ablation of Isl1. To gain a better understanding about the molecular functions of Isl1, I analyzed the expression of potential Co-Activators. RT-qPCR based screening in embryonic and adult pancreatic samples revealed a list of 12 candidate genes. RNA in-situ hybridization uncovered expression of 5 genes in the adult zebrafish endocrine pancreas, while the expression of 1 gene was restricted to the exocrine compartment. Subsequent biochemical analysis by Co-Immunoprecipitation (Co-IP) showed that at least two of the proteins (Ldb1a and Ldb2a) are able to bind in vitro to Isl1.