Titelaufnahme

Titel
Functionalisation and labelling of biologically relevant RNA based on chemical solid-phase synthesis / eingereicht von Veronika Schwarz
VerfasserSchwarz, Veronika
Betreuer / BetreuerinMicura, Ronald
Erschienen2015
UmfangIX, 130 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Enth. u.a. 3 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2013 - 2015 . - Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeJuni 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)preQ1-class II Riboschalter / 5-Aminopropargyluridin-Phosphoramidit / Convertible Nucleoside Approach
Schlagwörter (EN)preQ1-class II riboswitch / 5-Aminopropargyluridin-Phosphoramidite / Convertible Nucleoside Approach
Schlagwörter (GND)Nucleotide / Modifizierung / Fluorophore / Disulfidbrücke
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die vorliegende Doktorarbeit befasst sich mit modifizierten Nukleotiden, einschließlich deren Synthesen, deren Verwendung in der Oligonukleotid-Festphasensynthese und deren Anwendung in der Charakterisierung von strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Nucleinsäuren. Im Zentrum dieser Arbeit standen zwei unterschiedliche Typen von Modifikationen. Einerseits waren es Fluorophore mit deren Hilfe das Faltungsverhalten von biologisch relevanten nicht codierenden RNA sogenannten Riboschalters genauer untersucht wurden, andererseits waren es Disulfid-modifizierte Nukleotide mit denen ich mich näher beschäftig habe. Mit den Disulfid-modifizieren Nukleotiden war es möglich einen niedrig affinen RNA-Protein Komplex zu stabilisieren und zu kristallisieren, an Hand dessen eine Strukturbestimmung ermöglicht werden soll.

Das ersten Kapitel befasst sich mit der Untersuchung von Liganden abhängigen Faltungsmustern des S. pneumoniae (Spn) preQ1-class II mRNA Riboschalters. Ein Ziel war die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften des zusätzlichen Stammschleifenelements, des ansonsten „klassischer“ Pseudoknoten vorliegenden Riboschalters. Die große Herausforderung dabei war die Synthese von verschieden ortsmodifizierten preQ1-class II Derivaten für komplementäre chemische, biochemische und biophysikalische Methoden; einschließlich Mutationsanalysen, fluoreszenzmikroskopische Methoden wie z.B. 2-Aminopurin Spektroskopie und smFRET Messungen (in Zusammenarbeit mit Scott Blanchards Arbeitsgruppe; Weil Cornell Medical College, NY), und NMR Experimente, wie Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) Experimente (in Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von Martin Tollinger und Christoph Kreutz; Universität Innsbruck).

Um den Einfluss des Stammschleifenelements auf die Ligand-induzierte Pseudokonten Formation des Riboschalters mit fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersuchen zu können, wurden ortsspezifische Fluorophore entweder direkt mittels der Oligonukleotid-Festphasensynthese (z.B. 2-Aminopurin Phosphoramidit) oder über einen postsynthetischen Ansatz eingebaut. Dabei wurden zunächst speziell vorfunktionalisierte Nukleotide mittels Oligonukleotid-Festphasensynthese in die RNA integriert. Anschließend wurden an diese die für die jeweilige spektroskopische Methode notwendigen Fluorophore angebracht.

Die in dieser Arbeit vorliegenden Untersuchungen ergaben, dass das zusätzliche Stammschleifenelement (P4) einen signifikanten Einfluss auf das Faltungsverhalten des preQ1-class II Riboschalters hat. Die Analysen zeigten, dass dieses Strukturelement nicht nur einen Einfluss auf die intrinsische Dynamik sondern auch auf die Ligand Erkennung besitzt. Außerdem konnten wir zeigen, dass eine strukturelle Minimierung des Aptamers ohne Verlust der Liganden-Erkennung im Falle dieses Riboschalters möglich ist.1

Im zweiten Kapitel wird eine Strategie zur Synthese von 5-Aminopropargyluridin-Phosphoramidit vorgestellt, welches zurzeit nicht kommerziell erhältlich ist. In der Oligonukleotid-Festphasensynthese wird dieser Baustein für die ortsspezifisch Forfunktionalisierung der Nukleinsäuren verwendet. Diese Funktionalisierung ermöglicht eine anschließende postsynthetische Modifizierung mittels diversen chemischen Sonden. Der vorgestellte Syntheseweg wurde in Anlehnung an den von Sindbert und Mitarbeiter4 etablierten Zugang entwickelt. Dabei wurde ein besonderer Augenmerk auf den Austausch der 2‘-O-TBDMS Schutzgruppe4 durch die robustere 2-O-TOM Schutzgruppe gelegt.

Im letzten Kapitel wird die ortsspezifische Funktionalisierung eines kurzen Oligonukleotids beschrieben; dabei wurde der sogenannte „Convertible Nucleoside Approach“ angewandt. Das Verfahren wurde von Verdine und Mitarbeiter2, 3 vorgestellt und erlaubt die Stabilisierung von niedrig affinen Protein-RNA Komplexe, mit der Absicht diese zu kristallisieren. Die Methode basiert auf einer kovalente Verknüpfung zwischen einem Protein und seinem Oligonukleotidsubstrat. Diese Verknüpfung soll den RNA-Protein Komplex in einer ganz bestimmten Konformation stabilisiert, um eine Kristallisationsbildung leichter zu ermöglichen. Die Herausforderung hier war das Synthetisieren von Nukleinsäuren, in denen ein konvertierbares Nukleotid integriert wurde. Postsynthetisch wurde dann die für das Verfahren notwendige Disulfid-Einheit am konvertierbaren Nukleotid angebracht. Das in dieser Arbeit synthetisierte Oligonukleotid imitiert den T-Arm einer Transfer-RNA, die spezifisch durch eine Methyltransferase erkannt und an der Position A58 methyliert wird. Die anschließenden Verknüpfungsexperimente des Oligonukleotids mit der Thermus thermophilies m1A58-tRNA Methyltransferase wurden in Zusammenarbeit mit Carine Tisné (Université Paris Descartes) durchgeführt. Erste Kristallisationsexperimente waren erfolgreich und lassen auf eine Kristallstrukturaufklärung hoffen.

1. Souliere, M.F., Altman, R.B., Schwarz, V., Haller, A., Blanchard, S.C., Micura, R., Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013, 110(35), E3256-64.

2. Allerson, C.R., Verdine, G.L., Synthesis and biochemical evaluation of RNA containing an intrahelical disulfide crosslink. Chemistry & biology 1995, 2(10), 667-75.

3. Huang, H., Harrison, S.C., Verdine, G.L., Trapping of a catalytic HIV reverse transcriptase*template:primer complex through a disulfide bond. Chemistry & biology 2000, 7(5), 355-64.

4. Sindbert, S., Kalinin, S., Nguyen, H., Kienzler, A., Clima, L., Bannwarth, W., Appel, B., Muller, S., Seidel, C.A., Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. Journal of the American Chemical Society 2011, 133(8), 2463-80.

Zusammenfassung (Englisch)

The research presented in this thesis deals with various types of modified nucleosides, including their synthesis and incorporation into oligonucleotides. Thereby, the modification endows the oligonucleotide with properties that allow for in-depth structural and functional analysis of the nucleic acid of interest. Two types of modifications were in the center of my interests. On the one hand, fluorophores to enable studies on the folding behaviour of biologically relevant non-coding RNAs with a focus on mRNA riboswitches, and on the other hand, protein cross-linking moieties to enable structural studies of low-affinity RNA-protein complexes.

The thesis is divided into three chapters. In chapter 1, a comprehensive investigation on folding and ligand recognition of the S. pneumoniae (Spn) preQ1-class II mRNA riboswitch is described. The driving force for this undertaking was to understand this riboswitchs role in small-molecule-dependent gene regulation at the molecular level. In particular, I aimed at rationalizing the structural and functional impact of the additional stem-loop element in the context of its otherwise “classical” pseudoknot fold. A major challenge was here to synthesize appropriate preQ1-class II RNA variants for complementary chemical, biochemical, and biophysical approaches, including mutational analysis, 2-aminopurine fluorescence spectroscopy, single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) imaging (collaboration with the Blanchard group; Weil Cornell Medical College, NY), and advanced NMR spectroscopic experiments, namely Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) Echo Train Acquisition experiments (collaboration with the Tollinger and Kreutz groups; University of Innsbruck). More precisely, to assess the contribution of the stem-loop insertion to pseudoknot formation and ligand binding via fluorescence spectroscopy, Spn WT preQ1-class II riboswitch domains and counterparts with meaningful specific sequence deletions were synthesized containing diverse fluorophores. These modifications were site-specifically introduced either directly during solid-phase synthesis (i.e. using 2-aminopurine nucleoside phosphoramidites,) or via post-synthetic bioconjugation strategies that utilize a pre-functionalised nucleoside incorporated during solid-phase synthesis (e.g. aminoalkyl or aminoallyl modified nucleosides,) for subsequent fluorophore attachment of the deprotected RNA (e.g. by N-hydroxysuccinimidester(NHS) chemistry). Our investigations revealed that the unique stem-loop insertion (stem-loop P4) into the classical pseudoknot fold significantly impacts the preQ1-class II behaviour in the process of SD sequestration, by modulating both its intrinsic dynamics and its responsiveness to ligand binding. Furthermore, our results demonstrated that structural minimization of the aptamer through nucleotide deletions is possible; however, one of the loops (loop L3) is significantly more tolerant compared to the other one (loop L1) that contributes directly to binding site formation.1

In chapter 2, an efficient synthetic route for the yet not commercially available 5-aminopropargyl uridine phosphoramidite is described, following the lines of a published procedure by Sindbert and co-workers. Using solid-phase synthesis, this building block is needed for the site-specific internal pre-functionalisation of oligonucleotides, allowing for the subsequent attachment of diverse chemical labels. With respect to the building block design, special emphasis was laid on the replacement of the 2-O-TBDMS protection60 by the more robust 2-O-TOM protection, and furthermore, on upscaling of the synthesis.

In chapter 3, the site-specific functionalisation of a short oligonucleotide using a complex convertible nucleoside is described. The goal was to apply a technique originally presented by Verdine and co-workers2, 3 (the so-called “Convertible Nucleoside Approach”) to covalently link proteins to their nucleic acid substrates in order to stabilize the complex in a uniform conformation. This approach substantially increases the chances for crystallisation and structure determination by X-ray crystallography of low-affinity complexes. The specific challenge here was to synthesize oligo ribonucleotides with a convertible guanosine building block (2-fluoro inosine) and to post-synthetically introduce a tether containing a disulfide moiety. This moiety is reactive towards a properly positioned cysteine side chain of the target protein to form a covalent linkage. More specifically, our target oligonucleotide mimics the T-arm of a transfer RNA that is specifically recognized by a methyl transferase. The crosslinking and crystallisation experiments of the Thermus thermophiles m1A58-tRNA-methyltransferease in complex with the 17nt RNA were carried out in collaboration with the laboratory of Carine Tisné (Université Paris Descartes). First results confirmed efficient crosslinking and crystallisation of the target complex.

1. Souliere, M.F., Altman, R.B., Schwarz, V., Haller, A., Blanchard, S.C., Micura, R., Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2013, 110(35), E3256-64.

2. Allerson, C.R., Verdine, G.L., Synthesis and biochemical evaluation of RNA containing an intrahelical disulfide crosslink. Chemistry & biology 1995, 2(10), 667-75.

3. Huang, H., Harrison, S.C., Verdine, G.L., Trapping of a catalytic HIV reverse transcriptase*template:primer complex through a disulfide bond. Chemistry & biology 2000, 7(5), 355-64.

4. Sindbert, S., Kalinin, S., Nguyen, H., Kienzler, A., Clima, L., Bannwarth, W., Appel, B., Muller, S., Seidel, C.A., Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. Journal of the American Chemical Society 2011, 133(8), 2463-80.