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Titelaufnahme

Titel
Studien zur Struktur und Faltung gasförmiger Proteine mit FT-ICR Massenspektrometrie / von Moritz Schennach
VerfasserSchennach, Moritz
Begutachter / BegutachterinBreuker, Kathrin
Betreuer / BetreuerinBreuker, Kathrin
Erschienen2015
Umfang151 Bl. : zahlr. Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Zsfassung in engl. Sprache
Datum der AbgabeJuni 2015
SpracheDeutsch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Struktur / Faltung / Gasphase / ECD / proteins / FT-ICR
Schlagwörter (EN)structure / folding / gas phase / ECD / proteins / FT-ICR
Schlagwörter (GND)Cytochrom c / Lösungsmittel / Proteinfaltung / Gasphase / FT-ICR-Spektroskopie
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-2775 Persistent Identifier (URN)
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Studien zur Struktur und Faltung gasförmiger Proteine mit FT-ICR Massenspektrometrie [7.06 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die umstrittene Frage, ob die native Struktur eines Proteins in Lösung nach Transfer in die Gasphase erhalten bleibt, kann für die hier untersuchten Cytochrome c mit „Nein“ und für KIX mit „Ja“ beantwortet werden. Obwohl das spontane Entfalten der Cytochrome c aus Pferde und Thunfischherz ähnlich, mit Separation der terminalen Helices in einem ersten Schritt, verläuft, ist die Lösungsstruktur von Cytochrom c aus Thunfischherz in der Gasphase weniger stabil als die von Cytochrom c aus Pferdeherz. Dieser experimentelle Befund kann durch eine teilweise Stabilisierung durch elektrostatische Wechselwirkungen wie Salzbrücken, neutrale und ionische Wasserstoffbrückenbindungen und Ladungs-Dipol Wechselwirkungen erklärt werden. Besonders bemerkenswert ist, dass sich sowohl die globalen als auch die regionalen Stabilitäten der Proteine nach dem Transfer in die Gasphase umgekehrt verhalten wie in Lösung. So ist G für das globale Entfalten in Lösung für Cytochrom c aus Pferdeherz 42 2 kJ/mol bei 30 C [1], für KIX aber nur 12 1 kJ/mol bei 27 C [2]. Ebenso ist das regionale Entfalten in der Gasphase „auf den Kopf gestellt“: Die in Lösung stabilsten Regionen beider Cytochrome c sind die ersten, die nach dem Transfer in die Gasphase spontan entfalten. Für KIX hingegen entsprechen die relativen Stabilitäten der einzelnen Regionen in Lösung denen in der Gasphase.

Ob und wie Proteine in der Gasphase falten können, ist bisher kaum untersucht worden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Faltung von Proteinen in der Gasphase stattfinden kann, jedoch um Größenordnungen langsamer ist als in Lösung. Trotz fast gleicher nativer Struktur ist das Falten von Cytochrom c aus Pferdeherz sehr komplex und völlig anders als jenes von Cytochrom c aus Thunfischherz. Ebenso langsames Falten wurde für KIX 9+ Ionen beobachtet, wobei erstaunlicherweise weniger stark geladene Ionen auf der Zeitskala des Experiments gar kein Falten gezeigt haben. Diese gravierenden Unterschiede im Faltungsverhalten konnten primär auf die Ausbildung von Salzbrücken zurückgeführt werden.

Für das Protein KIX wurde außerdem untersucht, wie sich unterschiedliche Lösungsstrukturen nach der Desolvatation verhalten. Dazu wurde KIX aus unterschiedlichen Lösungsmitteln in die Gasphase gebracht und mit Wasserstoff/Deuterium Austausch (HDX) in der Gasphase,Elektroneneinfangdissoziation (ECD), Kronenether (CE) - Binden sowie Ionenmobilitäts Massenspektrometrie (IMS) untersucht.

Die HDX Experimente zeigten, dass im Gegensatz zum Austausch in Lösung, der Austausch in der Gasphase sehr komplex ist und nur begrenzt Schlüsse auf die Struktur der Proteinionen zulässt. Die Komplikation in der Dateninterpretation liegt darin, dass zwei gegenläufige Effekte - Ladung und Struktur - das Austauschverhalten bestimmen, wobei eine theoretische Vorhersage oder empirische Gewichtung der Effekte bisher nicht möglich ist.

Die ECD Daten zeigten Unterschiede im Fragmentierungsmuster für verschiedene Lösungsmittelzusammensetzungen. Mit zunehmender Denaturierung in Lösung wurden zunehmend offenere Gasphasenstrukturen beobachtet. Das Binden von Kronenether zeigte ebenfalls eine Zunahme mit zunehmender Denaturierung. Die Daten aus Experimenten mit IMS, die derzeit verstärkt zur Studie von Proteinstrukturen in der Gasphase eingesetzt wird, zeigten eine Streuung, die größer war als Unterschiede im Kollisionsquerschnitt von Ionen aus unterschiedlichen Lösungen; für alle Ionen wurde unabhängig von der Lösungsmittelzusammensetzung ein Anstieg im Kollisionsquerschnitt mit steigender Ladung festgestellt.

Die Daten und deren Interpretation im Rahmen dieser Dissertation bilden eine solide Grundlage für ein besseres Verständnis der intramolekularen Wechselwirkungen, die die Struktur, Stabilität und Faltung von Proteinionen in der Gasphase bestimmen. Damit kann die Entwicklung neuer massenspektrometrischer Methoden zur Studie von Proteinen und Proteinkomplexen entscheidend vorangetrieben werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The controversial question, whether a native structure of a solvated protein may be retained in the gas phase or not, could be answered for the proteins investigated in this thesis with “No” for Cytochromes c and with “Yes” for the three helix bundle protein KIX. Even though the spontaneous unfolding of both Cytochromes c from horse and tuna heart after transfer into the gas phase proceeds in a similar manner, the solution structure of Cytochrome c from tuna heart is far less stable compared to that from Cytochrome c from horse heart. This experimental finding can be rationalized by partial stabilisation by electrostatic interactions such as salt bridges, neutral and ionic hydrogen bonds, and charge-dipole interactions. Remarkably, both global and regional stabilities of these proteins after transfer into the gas phase are in reversed order compared to the solution phase. G values for the unfolding in solution of Cytochrome c from horse heart were determined as 42 2 kJ/mol [1] and as 12 1 kJ/mol for KIX [2]. Similarly, the regional unfolding in the gasphase is upside down: The most stable regions in solution of both Cytochromes c are the first regions which spontaneously unfold in the gas phase. However, the order of regional stabilities of gaseous KIX corresponds to those in solution.

Until now, there are only litte data from folding studies in the gas phase. In this thesis it could be shown that folding in the gas phase is orders of magnitudes slower than folding in solution. Despite highly similar solution structures, the folding behavior of Cytochrome c from horse heart in the gas phase is vastly dissimilar and far more complex than the gas phase folding behavior of Cytochrome c from tuna heart. Similarly slow folding behavior was observed for 9+ ions of KIX, whereas lower charged ions do not show any folding tendency on the timescale of the experiment. These tremendous differences in the folding behavior could be attributed primarily to the formation of salt bridges.

For the protein KIX it was furthermore studied, how different solution structures behave after desolvation. For this purpose, KIX from different solution compositions was transferred into the gas phase and studied with hydrogen/deuterium exchange (HDX) in the gas phase, electron capture dissociation (ECD), crown ether (CE) binding and ion mobility mass spectrometry (IMS).

HDX experiments show that the exchange in the gas phase is far more complex compared to the exchange in solution and thus obtaining information about protein ion structure is difficult. The problem ist, that two opposing effects charge and structure affect exchange. A theoretical prediction or an empirical weighting of these effects is currently not possible.

ECD data show differences in the fragmentation pattern of KIX from different solution compositions. With increasing denaturation in solution, increased unfolding was observed in the gas phase structures. Binding of crown ether also increased with increasing denaturation. Data from IMS experiments, which are currently popular for studying protein structures in the gas phase, showed variations that were larger than differences in collisional cross section (CCS) between KIX ions electrosprayed from different solution compositions; for all ions, independent of solution composition, an increase in their CCS was observed with increasing charge.

The data and their interpretation in this thesis provide a solid basis for a better understanding of the intramolecular interactions that define structure, stability and folding of gaseous protein ions. With that, new mass spectrometry methods for studying proteins and protein complexes can be developed.