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Title
Method development and validation of new analytical procedures for natural product analysis / by Judith Taibon
AuthorTaibon, Judith
CensorStuppner, Hermann ; Richomme, Pascal
Thesis advisorStuppner, Hermann ; Seger, Christoph
Published2015
Description145 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Date of SubmissionMay 2015
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Metarhizium / Destruxin / Risikobewertung / biologische Schädlingsbekämpfung / Methodenentwicklung / LC-MS / überkritische Flüssigchromatographie / bioautographischer Assay / HPTLC / Tyrosinase-Inhibitoren / Naturstoffe
Keywords (EN)Metarhizium / destruxin / risk assessment / biological pest control / method development / LC-MS / supercritical fluid chromatography / autographic assay / HPTLC / tyrosinase inhibitors / natural products / Metarhizium - destruxin - risk assessment - biological pest control - method development - LC-MS - supercritical fluid chromatography - autographic assay - HPTLC - tyrosinase inhibitors - natural products
Keywords (GND)Entomopathogene Pilze / Biologische Schädlingsbekämpfung / Diabrotica virgifera virgifera
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Abstract (German)

Diese Doktorarbeit wurde im Rahmen von zwei EU-Projekten, INBIOSOIL und NATPROTEC, durchgeführt, welche beide von der Europäischen Kommission im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms (RP7) finanziert wurden.

INBIOSOIL zielt auf die Entwicklung neuartiger ökoeffizienter und umweltfreundlicher Technologien ab um den Einsatz von konventionellen chemischen Pflanzenschutzmitteln zur Kontrolle von Bodenschädlingen zu verringern. Dafür sollen neue biologische Pflanzenschutzmittel basierend auf Formulierungen mit entomopathogenen Pilzen und Nematoden entwickelt werden. Um jedoch neue innovative Wirkstoffe tatsächlich auf den Markt bringen zu können, ist eine Risikobewertung hinsichtlich der Sicherheit gegenüber dem Menschen oder der Umwelt wichtig und notwendig.

In diesem Projekt liegt das Hauptaugenmerk auf den Einsatz des entomopathogenen Pilzes Metarhizium brunneum, welcher erfolgreich zur Bekämpfung des Maiswurzelbohrers (Diabrotica virgifera virgifera) und des Dickmaulrüsslers (Otiorhynchus sulcatus) eingesetzt wird. Zusätzlich zu den Metaboliten des Primärstoffwechsels, die für das Wachstum und Überleben des Organismus essentiell sind, sezerniert M. brunneum auch eine Vielzahl von Sekundärmetabolite, unter anderem Destruxine (dtxe), welche diverse bioaktive Wirkungen ausüben können. Allerdings gibt es Bedenken, dass diese Sekundärmetabolite in die Nahrungskette gelangen, und dadurch ein Risiko für Mensch und Umwelt darstellen könnten. Deshalb wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit neue analytische Methoden zum Nachweis von Destruxinen in verschiedenen Matrices wie Kulturmedien und Früchten entwickelt.

Für den qualitativen und quantitativen Nachweis der relevanten Destruxinformen, dtx A, dtx B und dtx E, in Kulturmedien konnten zwei verbesserte oder neue Analysemethoden, eine basierend auf Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (UHPLC) und die andere auf überkritischer Flüssigchromatographie (UHPSFC), entwickelt werden. Beide Methoden wurden hinsichtlich Probenvorbereitung und Analyten-Auftrennung optimiert und anschließend nach den bestehenden ICH-Guidelines validiert. Um Destruxin-Spuren in Früchten wie Erdbeeren und Mais nachweisen zu können, wurde ein auf der QuEChER-Methode basierendes Probenvorbereitungsprotokoll optimiert, welches die Extraktion dieser Metabolite im Spurenbereich gewährleistet.

Da Honig eines der wichtigsten natürlichen Produkte darstellt, und M. brunneum das Potential zur Kontrolle der Varroa Milbe (Varroa destructor), eine der größten Bedrohungen der Honigbiene (Apis mellifera), besitzt, wurde der optimierte Assay auf die Matrix Honig ausgeweitet um Honigproben auf Destruxinrückstände zu untersuchen.

NATPROTEC, das zweite EU-Projekt, hat zum Ziel, neue Naturstoffe mit hautschützenden sowie der Hautalterung und Überpigmentierung vorbeugenden Eigenschaften zu finden, welche in neuen kosmetischen Produkten verwendet werden können. Im Rahmen dieses Projektes wurde ein validierter HPTLC-basierender bioautographischer Assay zum Nachweis von natürlich vorkommenden Tyrosinase-Inhibitoren in Pflanzenextrakten entwickelt. Das Besprühen der entwickelten Platte mit einer optimierten Menge an Substrat und Enzym ermöglicht den Nachweis von Tyrosinase-inhibierenden Verbindungen als weiße Zonen auf schwarzem Hintergrund. Im Gegensatz zu früher entwickelten Verfahren, erlaubt der optimierte Assay, durch die Zugabe von Triton X-100 zur Substratlösung, den Ausschluss von falsch-positiven Ergebnissen.

Abstract (English)

This PhD thesis was performed in the framework of two EU projects, INBIOSOIL and NATPROTEC, both funded by the European commission under the Seventh Framework Programme (FP7).

INBIOSOIL aims at developing novel eco-efficient environmentally friendly technologies to reduce the input of conventional chemical pesticides for the control of subterranean pests. This is being accomplished through the generation of new formulations of biological control agents (BCAs) based on entomopathogenic fungi and nematodes. To introduce new innovative products to the market, risk assessment studies regarding the safety of humans or the environment are important and necessary.

The main focus of this thesis is on the entomopathogenic fungus Metarhizium brunneum, which is used successfully to control the western corn root worm (Diabrotica virgifera virgifera) and the vine weevil (Otiorhynchus sulcatus). In addition to the metabolites of the primary metabolism, essential for the growth and survival of the organism, M. brunneum produces various secondary metabolites such as destruxins (dtxs) which are known to exhibit a wide range of bioactivities. There are concerns that these secondary metabolites secreted by Metarhizium spp. might be able to enter the food chain posing a risk to humans and the environment. Therefore, within this thesis new analytical methods for the detection of traces of destruxins in different matrices such as culture media and fruits have been developed.

Two improved or new analytical methods could be established for the qualitative and quantitative detection of the relevant destruxin congeners, dtx A, dtx B and dtx E, in culture media, one based on ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) and the other on ultra-high performance supercritical fluid chromatography (UHPSFC). Both methods were optimized in terms of sample preparation and separation of analytes and subsequently validated according to the existing ICH guidelines. To detect destruxin traces in fruits such as strawberry and maize a QuEChER-based sample preparation protocol has been established which allows extraction of even traces of these metabolites. Since honey is one of the most important natural products and M. brunneum has the potential to be used to control the Varroa mite (Varroa destructor), one of the major threats of the honeybee (Apis mellifera), the optimized assay was also extended to the examination of honey samples for destruxin residues.

NATPROTEC, the second EU project has been involved in aims to discover novel natural products with skin-protecting, anti-ageing and anti-hyperpigmenting activities which could be used for the development of new cosmetic products. In the course of this project a validated HPTLC-based autographic assay for the detection of natural tyrosinase inhibitors in plant extracts has been established. The post-chromatographic spraying of an optimized amount of substrate and enzyme onto the entire plate enabled the detection of tyrosinase inhibiting compounds as white zones against a black background. In contrast to previously developed methods, the present HPTLC assay enabled the elimination of false positive results by the addition of Triton X-100 to the substrate solution.

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