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Title
Functional analysis of p27Kip1 [p27 hoch Kip1 ] modifications after DNA damage and during apoptosis / Podmirseg Silvio Roland
AuthorPodmirseg, Silvio Roland
CensorDoppler, Wolfgang ; Geley, Stephan
Thesis advisorHengst, Ludger
Published2015
Description153 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2015
Date of SubmissionMay 2015
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)p27 / Caspasen / RhoA / Zellzyklus / Apoptosis / Zellmigration
Keywords (EN)p27 / Caspases / RhoA / cell cycle / apoptosis / cell migration
Keywords (GND)Cyclin-abhängige Kinasen / Enzyminhibitor / Tumorsuppressor-Gen / Apoptosis / Zellmigration
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Abstract (German)

CDK-Inhibitor (cyclin dependent kinase) und Tumorsuppressor p27Kip1 ist ein wichtiger Regulator der Zellproliferation. In dieser Arbeit wurde eine neue ATM-Phosphorylierungsstelle (Ataxia telangiectasisia mutated) innerhalb des CDK-Inhibitors charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass p27 auf endogenem Level ATM abhängig modifiziert wird.

Die neue Modifizierungsstelle befindet sich innerhalb einer vorgeschlagenen Caspase-Schnittstelle. Wir nahmen an, dass Modifizierung innerhalb dieses Motivs zu einer Verhinderung der Prozessierung durch Caspasen führen würde. Jedoch wirkten sich Mutationen der Spaltstelle nicht negativ auf die Spaltung durch Caspasen aus. Die folgenden Untersuchen führten zur Lokalisieren der tatsächlichen Schnittstelle innerhalb von p27. Der Großteil der Ergebnisse findet sich in einem Papermanuskript, welches in den Ergebnisteil der Dissertation eingebettet ist, wieder. Entgegen der bisherigen Meinung verliert p27 nach dem Schnitt durch Caspasen nicht sein NLS (nuclear localization signal) und bleibt daher ein funktioneller Inhibitor von CDKs im Zellkern. Durch den Verlust von destabilisierenden Sequenzen führt die Prozessierung durch Caspasen zu einer Stabilisierung von p27 in Phasen des Zellzyklusses in denen das Protein normalerweise abgebaut wird.

Neben der Funktion als Zellzyklusregulator bindet p27 auch an RhoA. Die GTPase RhoA spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Zytoskeletts. p27 verhindert durch seine Interaktion die Aktivierung der GTPase, was zu einer Erhöhung der Zellmotilität führt. Nach dem proteolytischen Schnitt geht diese Funktion von p27 verloren. Die Kombination aus erhöhter Stabilität und Beeinflussung des Zytoskeletts könnte in Differenzierungsvorgängen von Bedeutung sein.

Es wurde auch beobachtet, dass die Überexpresssion des trunkierten CDK-Inhibitors zur einer erhöhten Apoptoserate nach DNA-Schädigung führt. Experimente zeigten, dass dieser Effekt von CDK- Inhibierung abhängig ist.

In Anbetracht der in dieser Doktorarbeit präsentierten Ergebnisse müssen die Konsequenzen von p27 Caspasespaltung innerhalb der Apoptose und innerhalb von caspaseabhängigen nicht-letalen Vorgängen neu interpretiert werden.

Abstract (English)

The CDK (cyclin dependent kinase) inhibitor and tumor suppressor p27Kip1 is an important regulator of cell proliferation. It induces cell cycle arrest by binding and inhibiting cyclin/CDK complexes. This work started with the characterization of a novel ATM (ataxia telangiectasia mutated) phosphorylation site in p27. With newly generated phospho-specific antibodies it was shown that after DNA damage the CDK inhibitor was modified at this new site. Furthermore it was demonstrated that p27 phosphorylation was ATM dependent.

The phosphorylation site is part of a suggested caspase cleavage motif. Proteases of the caspase family are the effectors of programmed cell death (apoptosis). We hypothesized that phosphorylation at the novel ATM site might affect caspase processing of p27. Surprisingly, mutation or phosphorylation of the proposed cleavage motif did not abolish caspase dependent processing of the CDK inhibitor. The investigations that followed lead to the identification of the caspase cleavage site in p27, which is distinct from the previously proposed one. Most of the presented results are part of a paper manuscript, which is embedded in the results part of this thesis. Importantly, cleavage at the novel site does not separate the NLS (nuclear localization signal) from the CDK inhibitory domain. Mutation of the new site renders p27 resistant to caspase cleavage in vitro and in vivo, and after cleavage the CDK inhibitor remains a functional inhibitor of nuclear CDKs. However, it is stabilized in cell cycle phases where the protein is normally unstable. The observed stabilization is most likely resulting from the loss of destabilizing sequences that are located in the C-terminus of p27.

Apart from regulating cell proliferation by binding and inhibiting CDKs, p27 also regulates cytoskeletal dynamics. The CDK inhibitor interacts with the small GTPase RhoA and thereby inhibits its activation. This study shows that after caspase dependent truncation, p27 can no longer interact with RhoA and inhibit its activation. As an important consequence p27 loses its ability to stimulate cell migration and cell invasion. The combination of enhanced stability and altered cytoskeletal dynamics could be of particular importance in caspase dependent differentiation processes. We started to look for p27 cleavage in different in vitro differentiation models. So far no significant processing of p27 was detected in cell culture based models.

Another important observation was that the overexpression of truncated p27 made cells more susceptible to apoptosis after mild DNA damage. Moreover, the truncated form of p27 exhibited a much higher stability than the wild type protein after the infliction of DNA damage. Experiments revealed that the pro-apoptotic effect of truncated p27 is most likely dependent on the inhibition of CDK activity.

Until today the common belief was that caspase processing of p27 results in a loss of function through mislocalization of the CDK inhibitor, like it is known for closely related p21Cip1/Waf1. The new findings presented here shed new light on possible functions of p27 during apoptosis and non-lethal caspase mediated cellular processes like differentiation.