Titelaufnahme

Titel
Enrichment and analysis of phosphopeptides : a combined experimental and theoretical approach / by Christoph Benjamin Messner
VerfasserMessner, Christoph Benjamin
Betreuer / BetreuerinBonn, Günther ; Rode, Bernd
Erschienen2015
Umfang146 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Enth. u.a. 9 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2013 - 2015
Datum der AbgabeApril 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Massenspektrometrie / Anreicherung / Phosphopeptide / Phosphoproteine / Lanthanoide / Quantenmechanik / Molekulardynamik
Schlagwörter (EN)mass spectrometry / enrichment / phosphopeptide / phosphoprotein / lanthanide ions / quantum mechanics / molecular dynamics
Schlagwörter (GND)Massenspektrometrie / Phosphopeptide / Lanthanoide / Quantenmechanik / Molekulardynamik
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Zusammenfassung (Deutsch)

Phosphorylierungen spielen eine wichtige Rolle bei vielen zellulären Prozessen und fehlerhafte Phosphorylierungen können mit unterschiedlichsten Krankheiten in Verbindung stehen. Daher ist die Charakterisierung und Identifizierung von Phosphorylierungsstellen von großer Bedeutung. Die massenspektrometrische Analyse von verdauten Proteinen hat sich hierfür als eine leistungsfähige Methode etabliert. Allerdings müssen die Phopshoproteine oder Phosphopeptide vor der Messung angereichert werden um ausreichende Signalintensitäten zu erhalten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, neue und innovative Anreicherungsverfahren zu entwickeln. Folgende Materialien wurden erstmals als stationäre Phasen für eine auf Chromatographie basierende Anreicherung verwendet: Metallorganische Gerüste bestehend aus Erbium(III)-Ionen und Phenyldiessigsäure; Erbium(III)phosphat eingebettet in Poly(glycidylmethacrylat/ethylendimethacrylat) Spin-Säulen; Poly(vinylphosphonsäure/divinylbenzol) beladen mit dreiwertigen Lanthanoid-Ionen. Außerdem wurde eine Methode entwickelt, bei dem die Phosphoproteine zuerst gefällt und dann auf dem Pellet verdaut werden. Die entwickelten Anreicherungsverfahren wurden sowohl auf Standard-Proteine als auch auf komplexere Proben wie Kuhmilch, Eiweiß, HeLa Zelllysat oder menschlicher Speichel angewandt. Zusätzlich zu den experimentellen Arbeiten wurden theoretische Rechnungen durchgeführt um ein besseres Verständnis der Anreicherungstechniken zu erlangen. Quantenmechanische Geometrieoptimierungen von Modellsystemen, ähnlich dem synthetisierten metallorganischen Gerüst beziehungsweise dem IMAC ergaben Wechselwirkungsenergien welche im Zusammenhang mit den beobachteten Adsorptionseigenschaften diskutiert wurden. Außerdem wurden quantenmechanische/molekularmechanische molekulardynamische Simulationen von chromatographisch relevanten Eisen(III)-Chelaten, La(III)-Phosphopeptid Komplexen sowie Erbium(III) in wässriger Lösung durchgeführt um Erkentnisse über IMAC und Fällungsmethoden zu gewinnen.

Die stoßinduzierte Dissoziation von Peptiden ist eine sehr populäre und leistungsstarke Fragmentierungstechnik zur Proteinidentifizierung. Bei Phosphopeptiden wird dabei hauptsächlich Phosphorsäure vom Vorläuferion abgespalten. Um neue Erkenntnisse über den Mechanismus dieser Abspaltung zu gewinnen, wurden Energieminima und Übergangszustände von mehreren relevanten Reaktionswegen mithilfe von quantenmechanischen Methoden berechnet.

Zusammenfassung (Englisch)

Phosphorylation plays a key role in a large number of cellular processes and dysfunctions of phosphorylation reactions are related to many diseases. Therefore, the identification and characterisation of phosphorylation sites is an important issue. The mass spectrometric (MS) based analysis of protein digests became a popular and powerful tool for this task. However, phosphopeptides or phosphoproteins have to be enriched prior to analysis in order to obtain sufficiently high signal intensities, especially when complex samples have to be analysed. One aim of this work was the development of new and innovative enrichment strategies. The following materials were successfully applied for the chromatographically based enrichment of phosphopeptides: metal-organic frameworks, consisting of Er(III) ions and 1,4-phenylenediacetate; erbium phosphate doped poly(glycidyl methacrylate/ethylene dimethacrylate) spin columns; poly(vinylphosphonic acid/divinylbenzene) loaded with lanthanide(III) ions. Furthermore, an approach was developed in which phosphoproteins were co-precipitated with different lanthanide phosphates and subsequently digested on the pellet. The developed enrichment techniques were applied to protein standards as well as more complex samples such as bovine milk, egg white, spiked HeLa cell lysates or human saliva. In addition to the experimental work, theoretical calculations were conducted in order to provide a better understanding of enrichment techniques. Quantum mechanical geometry optimisations of model systems related to a metal-organic framework and the newly developed IMAC provided interaction energies which were interpreted in conjunction with the observed affinity properties. Furthermore, hybrid quantum mechanics/molecular mechanics molecular dynamics simulations of chromatographically relevant Fe(III) chelates, La(III) phosphopeptide complexes as well as erbium(III) in aqueous solutions were performed to provide insights into IMAC as well as into precipitation techniques.

The collision induced dissociation of peptides is a prominent and powerful tool for MS/MS based protein identification. Thereby, the most abundant fragmentation reaction of phosphopeptides is the neutral loss of phosphoric acid from the precursor ion. In order to obtain mechanistic insights into this unimolecular dissociation, transition states as well as energy minima of several reaction pathways were evaluated, using quantum mechanical methods.