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Titelaufnahme

Titel
Highly Selective Enrichment Technologies for Purification and Identification of Phosphoproteins and Phosphopeptides / by Yüksel Güzel
VerfasserGüzel, Yüksel
Begutachter / BegutachterinBonn, Günther ; Rainer, Matthias
GutachterBonn, Günther ; Huck, Christian
Erschienen2015
Umfang172 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Enth. u.a. 8 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2012 - 2015 . - Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeJanuar 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Posttranslationale Modifikation / Proteomik / Phosphoproteomik / Phosphorylierung / phosphorylierte Peptide / phosphorylierte Proteine / Lanthanoide / Fällungsreaktion / Aluminiumsilikat / Erbiumphospahat / Menschlicher Speichel / Festphasenextraction / MALDI-MS
Schlagwörter (EN)Post-Translational Modifications / Proteomics / Phosphoproteomics / Phosphorylation / Phosphopeptides / Phosphoproteine / Lanthanide / Precipitation / Aluminum silicate / Erbiumphosphate / Human saliva / Solid-phase extraction / MALDI-MS
Schlagwörter (GND)Proteine / Phosphorylierung / Posttranslationale Änderung / Anreicherung
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-2168 Persistent Identifier (URN)
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Highly Selective Enrichment Technologies for Purification and Identification of Phosphoproteins and Phosphopeptides [21.72 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Post-translationale Modifikationen (PTM) von Proteinen nehmen Einfluss auf viele biologische Zellaktivitäten wie z.B. auf die Proteinregulierung, Signaltransduktion, das Zellwachstum oder die Zellteilung. Eine der bedeutendsten PTM ist die Phosphorylierung von Proteinen, die ein Schlüsselregulator in vielen zellulären Prozessen ist. In den letzten Jahren, hat die Massenspektrometrie für die Analyse von Protein-Phosphorylierungen deutlich an Bedeutung gewonnen. Die hohe Komplexität von biologischen Proben erfordert jedoch einen vorherigen Anreicherungs- oder Reinigungsschritt. Die physikalisch/chemischen Eigenschaften von phosphorylierten Peptiden oder Proteinen bilden hier den Ausgangspunkt für zahlreiche Anreicherungsstrategien. Diese Dissertation beschreibt zwei Strategien für die Anreicherung und Analyse von phosphorylierten Peptiden und Proteinen:

Der erste Ansatz stellt eine nicht-chromatographische Strategie, unter Verwendung der selektiven Co-Präzipitation phosphorylierter Proteine oder Peptide in Gegenwart von KH2PO4 und dreiwertigen Lanthanoid-Metallionen, dar. Lanthanoid-Metallionen zeigen starke Bindungseigenschaften für Moleküle mit sauerstoffreichen Gruppen, wie beispielsweise phosphorylierten Proteinen oder Peptiden. Durch diese Methode konnten Phosphoproteine und -peptide erfolgreich aus Standards, Rindermilch, Eiweiß, menschlichem Speichel und mit synthetischen Phosphopeptiden versetzten HeLa-Zelllysaten selektiv ausgefällt werden. Sämtliche Verunreinigungen und nicht-phosphorylierte Komponenten wurden durch umfangreiches Waschen der ausgefällten Komplexe entfernt. Für die nachfolgende massenspektrometrische Analyse wurden die Pellets mit verschiedenen Säuren, wie z.B. 30%iger Ameisensäure für Proteine, oder 3,7%ige Salzsäure für Peptide gelöst. Kolorimetrische Messungen ergaben eine Wiederfindung für Phosphoproteine von mehr als 95% für jedes der einzelnen Lanthanoidionen. In weiterer Folge erfolgte die Etablierung eines Workflows, der die selektive Fällung von Phosphoproteinen (top-down) mit anschließender Proteolyse am Pellet erlaubt. Unspezifische Proteine konnten durch mehrere Waschschritte entfernt werden. Nach dem tryptischen Verdau des Phosphoprotein-Komplexes, erfolgte die Gewinnung der phosphorylierten Peptide (bottom-up) durch Auflösen des Pellets mittels 3,7%iger Salzsäure für weitere massenspektrometrische Analysen.

Der zweite Teil dieser Arbeit basiert auf der Entwicklung und Optimierung neuer stationärer Phasen für die Anreicherung von phosphorylierten Peptiden. Als Anreicherungsmaterialien wurden Aluminiumsilikat (Mullit) und selbst-synthetisierte polymerische Spin-Columns mit eingebetteten ErPO4 entwickelt. Die neu-entwickelten stationären Phasen wiesen eine hohe Affinität zu phosphorylierten Peptiden auf. Die Effizienz dieser Materialien wurde für tryptisch verdaute Proteinstandards, Rindermilch, menschlichen Speichelproben, sowie mit synthetischen Phosphopeptiden versetzten HeLa Zelllysaten untersucht. Zur Immobilisierung der phosphorylierten Komponenten wurden die tryptischen Peptide zunächst auf die entwickelten Materialien geladen. In einem weiteren Schritt konnten unspezifische Verbindungen durch intensive Waschschritte entfernt werden. Schließlich konnten die angereicherten Phosphopeptide durch Anwendung basischer Bedingungen eluiert werden. Um die Selektivität der vorgestellten Methoden zu bestimmen, wurde die Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation Flugzeit Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) verwendet. Eine Vergleichsstudie mit herkömmlichen verwendeten Anreicherungsmethoden, wie beispielsweise TiO2, lieferte bessere Ergebnisse für die hier beschriebenen und entwickelten Materialien und Methoden.

Zusammenfassung (Englisch)

Post-translational modifications (PTMs) appoint proteins in biological cell activities e.g. protein regulation, signal transductions, cell growth or division. One of the most significant PTMs is phosphorylation of proteins that is a key regulator in many cellular processes. In order to obtain significant information regarding the phosphorylation in the cell, relevant studies have been dedicated to improve the enrichment technologies to reduce complexity of biological samples and to address the challenges of analytical measurements for mass spectrometry. The physical/chemical characteristics of phosphorylated peptides or proteins are the starting point for enrichment strategies. This dissertation describes two strategies for enrichment and analysis of phosphorylated peptides or proteins.

The first approach presents a non-chromatographic strategy using selective co-precipitation of phosphorylated proteins or peptides in the presences of KH2PO4 and trivalent lanthanide metal ions. Lanthanide metal ions exhibit strong binding properties for molecules with oxygen-rich groups such as phosphorylated proteins and peptides. Thus, they could be successfully precipitated from standard mixtures, bovine milk, egg white, human saliva and spiked HeLa cell lysates. The contaminants and non-phosphorylated proteins or peptides were removed by extensive washings of the precipitated pellets, permitted through their very low solubility products. For the subsequent mass spectrometric analysis, the pellets were dissolved with different acid conditions, such as 30% formic acid for proteins and 3.7% hydrochloric acid for peptides. Colorimetric detection provided more than 95% protein recovery for each of the lanthanide ion by co-precipitation of phosphoproteins.

Precipitation at the protein level (top-down) and peptide level (bottom-up) were combined to achieve high recoveries of phosphopeptides employing tryptic digestion of phosphoproteincomplexes on-pellet. Unspecific proteins were removed from precipitated phosphoproteins through several washing steps. After trypsin-assisted digestion of phosphoprotein-complexes, the phosphorylated peptides retained on to pellet and could be recovered by dissolving the purified pellet using 3.7% hydrochloric acid prior mass spectrometric analysis.

The second part of this thesis is based upon designing and developing novel stationary phases for the enrichment of phosphorylated peptides. Nontoxic and inexpensive aluminium silicate (mullite) and self-synthesized ErPO4-embedded polymeric spin columns were employed as two novel sorbents in phosphoproteomics. The presented stationary phases revealed enhanced affinity for phosphorylated peptides. The efficiency of these methods was investigated for tryptic digested protein mixtures, bovine milk, spiked HeLa cell lysate and human saliva samples. For the immobilization of phosphorylated peptides, tryptic peptides were first loaded on the self-assembled columns. In a further step, unspecific compounds were removed through intensive washing steps. Finally, the successfully captured phosphopeptides were eluted at basic conditions.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was applied for all the measurements and to evaluate the high selectivity of the presented methods. A comparative study was performed with conventional sorbents i.e., TiO2, which revealed superior results for all of the reported phosphopeptide enrichment approaches.

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