Titelaufnahme

Titel
Synthese von modifizierten Riboschalter-Liganden, Cyanin-Farbstoffen, und ihren Konjugaten / von Jasmin Levic
VerfasserLevic, Jasmin
Begutachter / BegutachterinMicura, Ronald ; Grubmayr, Karl
GutachterMicura, Ronald
Erschienen2015
UmfangIV, 204 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Zsfassung in engl. Sprache
Datum der AbgabeJanuar 2015
SpracheDeutsch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Liganden / Synthese / PreQ1 / Farbstoffe / SAM
Schlagwörter (EN)Ligands / synthesis / preQ1 / dyes / SAM
Schlagwörter (GND)Riboswitch / Ligand / Cyaninfarbstoff / Chemische Synthese
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Zusammenfassung (Deutsch)

erste Teil der Disseration beschreibt die Synthese von modifizierten 7-(Aminomethyl)-7-deazapurin(preQ1)-Derivaten. 15N-Atome wurden an bestimmten Positionen eingebaut, wobei drei preQ1-Basen, die an den Positionen [15N1, 15N3, H215N(C2)], [15N9] und [H215N(C7‘)] markiert wurden, erhalten wurden. Die Syntheserouten verliefen in fünf bis sieben Stufen, bei denen der entscheidende Schritt eine Reaktion von in situ -bromiertem 3-Phthalimidopropanal mit 2,6-Diaminopyrimidin-4-on darstellte. Die Gesamtausbeuten waren sehr gut bis exzellent. Des Weiteren erlaubten diese Synthesestrategien die Verwendung von kostengünstigen 15N-Quellen wie [15N]-KCN, [15N]-Phthalimid, sowie [15N3]-Guanidin. Aufgrund der sorgfältig optimierten RP-Chromatographie-Protokolle erzielte man eine ausgezeichneter Reinheit der jeweiligen Nucleobasen. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Christoph Kreutz (Universität Innsbruck) konnten die 15N-markierten preQ1-Basen im Zusammenhang mit RNA-Bindung und der zugrundeliegenden Dynamik von preQ1-Riboschaltern getestet und analysiert werden.

Ein weiteres wichtiges Ziel war die Synthese von preQ1-Basen mit einer Azido- beziehungsweise einer Aminoalkylfunktionalität. Um möglichst geringe Interferenz während der RNA-Ligand-Bindung zu generieren, sollte die Anknüpfung der oben genannten Alkyleinheiten an die H2N(C7‘) Gruppe erfolgen. Dies wurde durch die Derivatisierung der Aldehydkomponente in der bewährten Reaktion von in situ -bromierten Aldehyd und 2,6-Diaminopyrimidin-4-on realisiert. Die Azido- und Aminoalkyl modifizierten preQ1-Basen wurden in acht Stufen mit guten Ausbeuten erhalten.

Um eine wichtige Anwendung der Azido- und Aminoalkyl-preQ1-Basen zu demonstrieren, wurden Farbstoff-preQ1-Konjugate generiert. Diese Derivate sind von grundlegender Bedeutung in der Analyse und Evaluierung von preQ1-RNA Interaktionen mittels Methoden wie „steady-state“-Fluoreszenz, „microscale thermophoresis“ (Nanotemper), sowie „single-molecule Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer“(smFRET)-Spektroskopie. Die entsprechenden Cyanin (Cy) Farbstoffe wurden an die preQ1-Derivate einerseits mittels klassischer N-Hydroxysuccinimid(NHS)ester-Chemie, und andererseits mit Kupfer(I)-katalysierter Klick-Chemie gekoppelt. In enger Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Scott C. Blanchard (Weill Cornell Medical College, NY) werden einige dieser Derivate derzeit genutzt, um RNA-Ligand Wechselwirkungen im Zusammenhang mit der Genregulation durch Riboschalter zu erforschen.

Der zweite Teil der Dissertation handelt von der Synthese von Aza-modifizierten S-Adenosylmethionin (SAM). Das Design dieser Derivate erlaubt eine in situ Bildung einer Aziridinium Gruppe, die der ursprünglichen, positiv geladenen Sulfonium Gruppe ähnlich ist. Zwei dieser modifizierten SAM-Analoga wurden in Anlehnung an bekannte Vorschriften synthetisiert. Für beide Analoga war der entscheidende Syntheseschritt die reduktive Aminierung eines entsprechend geschützten 5‘-Aminoadenosins mit einem Asparagin- beziehungsweise Glutaminsäurederivat, welche reduzierte Seitenketten aufwiesen. In elf Stufen wurden beide Analoga in guten Ausbeuten erhalten. Der finale Reinigungsschritt wurde mittels RP-Chromatographie durchgeführt und lieferte hohe Reinheit der Produkte.

Um eine mögliche Bindung der synthetisierten Aza-modifizierten Liganden an Riboschaltern zu eruieren, wurden Fluoreszenzstudien mit 2-Aminopurin markierter RNA durchgeführt. Beide Derivate zeigten, dass sie an den Klasse-II SAM-Riboschalter binden, aber im Vergleich zum natürlichen SAM-Liganden geringere Affinität aufweisen.

Der dritte Teil der Dissertation beschreibt die Synthese von Fluoreszenzfarbstoffen. Alle dargestellten Farbstoffe basierten auf dem Strukturtyp der Cyanine, insbesondere Cy2b, Cy3 und Cy5. Das Design der Farbstoffvarianten wurde von dem Ziel geleitet, Funktionalitäten zur weiteren Derivatisierung anzubringen, und außerdem funktionelle Gruppen zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften gegenüber „photobleaching“ und „blinking“ einzuführen. Darüberhinaus sollte auf die hohe Wasserlöslichkeit geachtet werden. Der Schlüsselschritt bei der Bildung des Cyaningrundgerüstes war die Kondensation von 1-Alkyl-2-methylindolenin Derivaten mit N,N‘-Diphenylformamidin (bzw. Homologen) in Anwesenheit von Essigsäureanhydrid zu den Acetanilidylalkenyl-Salzen. Die dabei entstandenen Intermediate wurden anschließend mit einem zweiten Methylindolium Salz umgesetzt. Es wurden zwei Synthesezugänge ein symmetrischer und ein unsymmetrischer erarbeitet, wobei der letztere die prinzipielle Möglichkeit für weitere schnelle Derivatisierung eröffnet. Cyanin-Farbstoffe, die Cyclooctatetraen(COT)- oder Phthalimidreste enthalten, wurden in größeren Mengen und hoher Reinheit hergestellt. Zusätzlich wurden Amino-modifizierte Cy3 und Cy5 Farbstoffe erhalten. Diese Derviate dienen derzeit als Ausgangspunkt zur Erweiterung der Strukturvielfalt, sowie der Funktionalisierung mit neuen potentiellen Stabilisatoren

Zusammenfassung (Englisch)

The first part of this thesis describes the synthesis of modified 7-(aminomethyl)-7-deazapurine (preQ1) derivatives. 15N atoms were incorporated in site-specific manner to obtain three preQ1 base derivatives with complementary 15N-labeling patterns, namely [15N1, 15N3, H215N(C2)], [15N9], and [H215N(C7')] respectively. The synthetic pathways comprised five to seven steps and relied on the key reaction of in situ -brominated 3-phthalimidopropanal with 2,6-diamino-pyrimidin-4-one. Overall yields were in the range of very good to excellent. Furthermore, the synthetic design allowed the use of the cost-affordable 15N sources [15N]-KCN, [15N]-phthalimide, and [15N3]-guanidine. Importantly, purification protocols using reversed-phase (RP column chromatography were elaborated and gave the nucleobase derivatives in excellent purities. In a collaborative effort with the research group of Christoph Kreutz (University of Innsbruck), the 15N-labeled preQ1-bases were analyzed in the context of ligand binding and ligand binding dynamics of preQ1-riboswitches.

A related synthetic aim concerned the tethering of preQ1 bases with azido- and aminoalkyl moieties. For reasons of minimal interference during RNA-ligand binding, the tether should be attached at the H2N(C7') group. This structural requirement was successfully achieved by appropriate derivatization of the aldehyde component of the above mentioned key reaction of in situ -brominated aldehyds with 2,6-diamino-pyrimidin-4-one. The azido- and aminoalkyl tethered preQ1 bases were obtained in eight steps with good yields.

To demonstrate an application for the azido- and aminoalkyl preQ1 bases, fluorescent dye-preQ1 conjugates were generated. Such derivatives are of high importance to study preQ1 RNA interactions using methods that range from basic steady-state fluorescence binding studies, to recently introduced microscale thermophoresis (Nanotemper) approaches, up to sophisticated single-molecule Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (smFRET) spectroscopy. Primarily, cyanine dyes (Cy dyes) were attached to the preQ1 derivatives using classic N-hydroxysuccinimid(NHS) ester chemistry and Cupper(I)-catalyzed Click chemistry, respectively. In a collaboration with the laboratory of Scott C. Blanchard (Weill Cornell Medical College, NY), several of these derivatives are currently involved in smFRET RNA-ligand studies to explore the mechanism of riboswitch gene regulation.

The second part of this thesis describes the synthesis of aza-analogs of S-adenosylmethionine (SAM). The design of these derivatives allows for in situ formation of an aziridinium group that was proposed to mimic the original, positively charged sulfonium group. Following known procedures, the synthesis of two such modified SAM analogs was elaborated and significantly optimized. For both, the key reaction was the reductive amination of an appropriately protected 5-amino adenosine and aspartic or glutamic acid precursors with reduced side chains. The eleven-step synthesis proceeded in good yield and the final purification step via RP-column chromatography provided these derivatives in excellent purities.

To evaluate the binding capacity of the synthesized aza-modified SAM derivatives to riboswitches, qualitative fluorescence binding assays based on 2-aminopurine labeled RNA were performed. Both derivatives indicated binding to the SAM(II) riboswitch motif, however, the estimated binding affinities appear much lower compared to the natural SAM ligand.

The third part of this thesis describes the synthesis of fluorescent dyes and derivatives thereof. All of them refer to the structure of cyanines with a major focus on Cy2b, Cy3 and Cy5. The design of the various compounds was guided by the aim to attach tethers that either allow for further modification or directly carry functional moieties that improve the fluorescence properties of the original chromophore with respect to photobleaching and blinking. Moreover, pronounced water solubility of the dyes should be given. The key step to build up the cyanine core was the condensation of 1-alkyl-2-methyleneindoline derivatives with N,N-diphenylformamidine (or homologues) in the presence of acetic anhydride to afford acetanilidylalkenyl indolium salts. The resulting intermediates were then reacted with a second methylindolium salt. Based on this concept, two pathways a symmetric and an unsymmetric one were created, the latter provides the principal possibility for further modification with functional entities. Thus, cyanine dyes with cyclooctatetraene (COT) and phthalimide derivatives as protective agents were prepared in large amounts and high purities. Additionally, amino-modified Cy3 and Cy5 dyes were obtained. These derivatives currently serve as the starting point for increased structural diversity and to explore their functionalization with novel potential protective agents.