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Titelaufnahme

Titel
Physiological Stress : an instructive determinant of mesenchymal stem cell fate / Sebastian Klepsch
VerfasserKlepsch, Sebastian
Begutachter / BegutachterinnenBauer, Hans ; Sampson, Natalie
Betreuer / BetreuerinnenLepperdinger, Günter
Erschienen2015
Umfang164 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2015
Datum der AbgabeJanuar 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Mesenchymale Stammzellen / Stress / Differenzierung / Osteozytogenese / 3D Organoide / Reaktive Sauerstoffspezies / o-Glykosylierung / Defekt in der Ratten Calvaria / Stress Granula / Translatomics
Schlagwörter (EN)Mesenchymal stem cells / stress / differentiation / osteocytogenesis / 3D mesenspheres / reactive oxygen species / o-glcyosylation / critical size defect in the rat calvaria model / stress granules / translatomics / Mesenchymal stem cells - stress - differentiation - osteocytogenesis - 3D mesenspheres - reactive oxygen species - o-glcyosylation - critical size defect in the rat calvaria model - stress granules - translatomics
Schlagwörter (GND)Mesenchymzelle / Stammzelle / Zelldifferenzierung / Hyaluronatsynthase / Enzyminhibitor
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-1716 Persistent Identifier (URN)
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Physiological Stress [7.97 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Stammzellforschung im Kontext regenerativer Maßnahmen, stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, um einer alternden Bevölkerungsstruktur in Europa die Aussicht auf gesundes Altern zu ermöglichen. Das Forschungsziel dieses Projektes beruht darauf, molekulare Mechanismen der osteogenen Differenzierung von adulten mesenchymalen Stammzellen besser zu verstehen und diese gewonnen Erkenntnisse für mögliche Therapie Ansätze nutzbar zu machen.

Versuche mit humanen MSZ, die in 3D Kultur unter Zugabe von 4-Methylumbelliferone (4-MU) einem in der Klinik bereits erfolgreich eingesetztem Choleretikum und muskulotropen Spasmolytikum Anwendung findet, osteogen differenziert wurden, führten zu einer terminalen Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu Osteozyten. Diese Differenzierung ist bisher in vitro noch nie erzielt worden. Bei der Differenzierung mit 4-MU deutet die damit verbundene verstärkte Einlagerung von Kalziumphosphat in die zelluläre Umgebung darauf hin, dass dieser Wirkstoff auch zur Verbesserung der Knochenheilung eingesetzt werden könnte. Vorexperiment in einem knöchernen Defekt Model der Ratten Calvaria, bestätigten die verbesserte Verknöcherung des Defektes unter 4-MU Gabe.

Untersuchungen der zu Grunde liegenden Mechanismen legen die Vermutung nahe, dass 4-MU im Zuge des Detoxifikationsprozesses zum einen in den UDP N-Acetlylglucosamin Haushalt der Zelle eingreift und somit zu einer Veränderung von posttranslational modifizierten Proteinen führt und zum anderen die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies induziert. Beide Eingriffe sind in der Literatur mit der Bildung von so genannten Stress granules assoziiert, die als Scheidepunkt für spezifische mRNAs gelten, ob diese abgebaut, gelagert oder der Translation mit erhöhter Effizienz zu geführt werden. Die Analyse der unter 4-MU Gabe gebildeten Stress granules zeigte die Präsenz von mRNA die entscheidend für die osteogene Differenzierung von humanen MSCs ist und könnte somit als mögliche Erklärung für die verbesserte Osteogenese dienen.

Zusammenfassung (Englisch)

Stem cells are vitally involved in tissue regeneration and homeostasis in later life. Mesenchymal stem cells (MSC) are one particular type of tissue specific adult stem cells that can differentiate into mesoderm-type cells, such as osteoblasts, chondrocytes and adipocytes (Dominici, Le Blanc et al. 2006). However osteocytes cannot be cultivated nor is it possible to study their development in vitro. So far no protocol has been established which would allow osteocyte differentiation starting from their natural precursors which are commonly believed to be mesenchymal stem cells (MSC). Treatment of human bone marrow derived MSC with the hyaluronan synthase inhibitor 4-Methylubelliferone (4-MU) (Edward, Quinn et al. 2010) not only promotes osteogenesis in vitro but induces a novel cellular phenotype that closely resembles osteocytes in vivo.

Investigating the underlying mechanisms of this enhanced differentiation process, we observed that 4-MU specifically triggers the formation of stress granules (SG), which is described as a common stress response in most eukaryotic cells. These RNA-protein complexes contain non-translating mRNAs, translation initiation components, and many additional proteins affecting mRNA function and therefore are believed to serve as a decision point for untranslated mRNAs to become stored, degraded or rerouted for enhanced translational re-initiation (Buchan and Parker 2009). Analyzing the mRNA content of the formed SG via pull down experiments and RT-PCR, revealed the presence of markers (RUNX2, Col1A1, IBSP) known to be important for osteogenic differentiation. Furthermore we hypothesize that 4-MU caused SG formation is based on a two way mode of action. First we could show that 4-MU treatment leads to elevated levels of cellular UDP-GlcNAc which serves as a substrate for O-linked N-acetylglucosamine modification of proteins, an important posttranslational modification which has been associated with osteogenesis (Kim, Kim et al. 2007). In addition O-GlcNAc modification of ribosomal proteins has been linked to stress granule assembly (Ohn, Kedersha et al. 2008) and therefore could explain our findings.

Apart from increased O-GlcNAc modification of ribosomal proteins, oxidative stress is described as a potent stress granule inducer (Takahashi, Higuchi et al. 2013), we could show in several experiments that 4-MU is a potent ROS inducer and therefore hypothesize this dual mode of mechanism facilitating stress granule formation.

In parallel we performed 3D culture of human mesenchymal stem cells to mimic the in vivo situation. We could show that 4-MU treatment in combination with osteogenic differentiation results in pattern formation and microstructures, closely resembling the in vivo situation of trabecular bone marrow. These micro organoids could serve as a potent tool and surrogate model for research on the stem cell niche and hematopoiesis. In addition we could show in an in vivo critical size defect model in the rat calvaria that the application of 4MU in combination with BMP-2 resulted in a significant increase of bone regeneration compared to BMP-2 alone, suggesting a potential therapeutical application of the FDA approved coumarin 4-MU.

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