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Titelaufnahme

Titel
Chromatin remodeling and immunity control in "Drosophila melanogaster" / Johanna Sebald
VerfasserSebald, Johanna
Begutachter / BegutachterinRedl, Bernhard
GutachterLusser, Alexandra
Erschienen2015
Umfang182, 12 Bl. : Ill., graph. Darst., Kt.
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Enth. u.a. 1 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2012 . - Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeJanuar 2015
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)CHD1 / Chromatin / Drosophila / Immunantwort / Darm
Schlagwörter (GND)Taufliege / Chromatinremodellierung
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-1724 Persistent Identifier (URN)
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Chromatin remodeling and immunity control in "Drosophila melanogaster" [18.49 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Chromatin remodeling und assembly Faktor CHD1 gehört zur Familie der SNF2-Typ ATPasen. Die Beteiligung von CHD1 an der Regulation der Transkription und verschiedener Chromatinfunktionen konnte für eine Vielzahl an eukaryotischen Organismen gezeigt werden. Unsere Arbeitsgruppe fand heraus, dass CHD1 in Drosophila in die Reorganisation des väterlichen Chromatins während der Befruchtung involviert ist. Die Colokalisierung von CHD1 mit der elongierenden Form der RNA Polymerase II, sowie die Beteiligung an der Transkription spezifischer Hitzeschockgene sprechen für eine regulatorische Funktion innerhalb der Transkription. Darüber hinaus, deuteten im Verlauf meiner Masterarbeit durchgeführte Infektionsexperimente eine bisher unbekannte Funktion von CHD1 innerhalb der lokalen Immunantwort im Darm der Fruchtfliege an.

Basierend auf dieser Erkenntnis, bildete die Analyse potentieller Mechanismen die dieser neuartigen Funktion von CHD1 zugrunde liegen einen wesentlichen Aspekt meines PhD Projektes. Wir konnten zeigen, dass die Transkription antimikrobieller Peptide im Darm von Chd1 Mutanten im nicht-infizierten Zustand bereits signifikant erhöht war. Gleichzeitig wiesen die Därme dieser Fliegen jedoch erhöhte bakterielle Titer auf. Die orale Infektion mit bestimmten Erregern ging zudem mit einer drastischen Anreicherung von Bakterien im Körper von Chd1 defizienten Fliegen einher. Dies deutete auf erhöhten Durchtritt der Bakterien durch das Darmepithelium dieser Fliegen hin. Wir vermuten, dass die erhöhte Durchlässigkeit des Darmepitheliums sowie die daraus resultierende Bakteriämie eine Ursache für die erhöhte Sterblichkeit der Chd1 Mutanten in Folge einer bakteriellen Infektion sein könnte. Im Zuge einer intensiveren Analyse des Einflusses von CHD1 auf die bakterielle Besiedlung des Darms untersuchten wir die Zusammensetzung des Darmmikrobioms der Fruchtfliege mittels 16S rDNA spezifischer Amplikonsequenzierung. Diese Analyse offenbarte den fast vollständigen Verlust bakterieller Spezien-Vielfalt im Darm von Chd1 defizienten Fliegen. Es erscheint daher plausibel, dass CHD1 zum Erhalt der bakteriellen Diversität im Darm von Drosophila beiträgt. In Anbetracht der Bedeutung eines ausgeglichen Zusammenspiels von Wirt und Darm-assoziiertem Mikrobiom, schlussfolgerten wir, dass die Veränderungen des Darmmikrobioms in der Abwesenheit von CHD1 zumindest zum Teil zum Phänotyp Chd1 defizienter Fliegen beitragen könnte. Dieser ist unter Anderem durch eine verringerte Anzahl an Nachkommen, eine verkürzte Lebensdauer und eine beträchtliche Immunschwäche gekennzeichnet. Unsere Studien wiesen ziemlich deutlich auf eine Beteiligung von CHD1 an der Regulation von Prozessen, die mit dem Darm in Verbindung stehen hin. Da die Verwertung von Nahrungsmitteln den zentralen im Darm stattfindenden Prozess darstellt, beschlossen wir die Nahrungsaufnahme von Chd1 Mutanten genauer zu untersuchen. Diese Analysen zeigten, dass Chd1 defiziente Tiere wesentlich weniger Nahrung konsumierten als Kontrollfliegen. Die Experimente die bis dato durchgeführt wurden um die Ursachen der reduzierten Nahrungsaufnahme der Chd1 Mutanten zu bestimmen, deuten auf eine Beeinträchtigung des Insulin Signalwegs hin.

Der zweite Teil meiner Arbeit basiert auf dem Vergleich der Genexpression von Drosophila Larven, die entweder kein funktionsfähiges CHD1 Protein produzieren oder Nullmutationen des H2A.Z Austauchfaktors domino oder der Histonacetyltransferase Elp3 tragen. Wir konnten zeigen, dass die Expression spezifischer Gene, die in die Antwort auf Stress oder die Immunantwort der Fliege involviert sind, in allen drei Mutanten hochreguliert wurde. Dies legt die Vermutung nahe, dass die drei Chromatin remodeling Faktoren eine kooperative Rolle innerhalb der Regulation wichtiger Prozesse in der Fliege einnehmen könnten. Genetische Interaktionsstudien mit transheterozygoten Deletionsmutanten wiesen auf eine gemeinsame Funktion von CHD1 und DOM innerhalb der Darm-spezifischen Immunantwort der Fruchtfliege hin. Elp3 jedoch scheint als Antagonist von CHD1 und/oder DOM zu fungieren. Um die Auswirkung von CHD1, DOM und Elp3 auf die Genexpression in einer direkteren Art und Weise analysieren zu können führten wir einen auf RNAi-basierenden knock-down der drei Faktoren mit anschließender RNA-Seq Analyse in S2 Zellen durch. Obwohl es uns gelang die Expressionslevel aller Faktoren zu reduzieren, stellte sich heraus, dass sich die verringerte Konzentration der entsprechenden Faktoren nur geringfügig auf das Transkriptom der Zellen auswirkte. In einem weiteren Versuch, der ebenfalls darauf abzielte die transkriptionelle Co-Regulation zwischen CHD1, DOM und Elp3 aufzuklären, analysierten wir das Interaktom von CHD1 mittels Co-Immunopräzipitation und Massenspektrometrie einer Affinitätsreinigung eines getaggten CHD1 Proteins. Eine stabile Interaktion zwischen CHD1 und DOM/Elp3 konnte allerdings mit keiner der Methoden nachgewiesen werden.

Zusammenfassung (Englisch)

CHD1 is a chromatin remodeling and assembly factor of the SNF2 family of ATPases. It has been demonstrated to be involved in the regulation of transcription and of chromatin functions of various eukaryotic organisms. We have recently shown that in Drosophila CHD1 is involved in the reorganization of paternal chromatin during fertilization. Its colocalization with elongating RNA polymerase II and its impact on the trancription of heat shock genes strongly suggest a role as transcriptional regulator. Infection experiments performed during my masters studies pointed towards a yet unknown role of CHD1 within the intestinal immune response of Drosophila melanogaster.

Thus, one major aspect of my Phd project was to elucidate the mechanisms underlying this novel function of CHD1 in the fly. We found that in Chd1 mutant flies gut-specific transcription of antimicrobial peptide genes was significantly elevated in the absence of infection. At the same time, we observed increased microbial colonization of the intestine of these flies. Moreover, we showed that oral infection resulted in strong enrichment of bacteria in the body cavity of Chd1 deficient flies, pointing towards increased microbial passage across the gut epithelium. We speculated that the permeability of the gut epithelium of Chd1 mutants and the subsequent systemic bacteremia might be the cause of the increased mortality of these flies upon bacterial challenge. In order to further investigate the impact of CHD1 on the bacterial colonization of the gut we analyzed the intestinal microbiome composition by 16S rDNA specific amplicon sequencing. These analyses revealed the almost complete loss of bacterial species diversity in the gut of Chd1 mutants, thus pointing towards a role of CHD1 within the maintainance of the intestinal species variety. Given the importance of a balanced crosstalk between the host and its associated microbiota, we speculated that the alterations within the intestinal microbiome composition in the absence of CHD1 might at least contribute to the Chd1 pehnotype, which is amongst others reflected by reduced viability and longevity as well as considerable immune-deficiencies. Given that our results clearly pointed towards an involvement of CHD1 in the regulation of gut-associated processes in the fly and food metabolism is the major process taking place in the gut, we sought to investigate the feeding behavior of Chd1 mutant flies. Feeding assays revealed that food intake was significantly reduced in flies lacking CHD1. Further analyses of the mechanisms that might underlie these food restriction pointed towards an impairment of the insulin/insulin-like growth factor (IlS) pathway in Chd1 deficient animals.

The second part of my thesis was based on the comparison of gene expression profiles that uncovered unexpected similarity in the patterns of genes misregulated in larvae missing either Chd1, the variant histone H2A.Z exchange factor domino or the histone acetyltransferase Elp3. In particular, we found that similar genes involved in immunity and stress response were upregulated in all three mutants pointing towards a potential cooperation of the three chromatin remodeling factors in the regulation of important biological functions in Drosophila. Genetic interaction studies with transheterozygous deletion mutants suggested a common regulatory role of CHD1 and DOM in the gut-specific immune response of the fly, whereas Elp3 seemed to act in an antagonistic fashion. Moreover, RNAi-based knockdown of the factors and subsequent RNA-seq analysis was performed in Drosophila S2 cells to more directly study the effects of CHD1, DOM and Elp3 on gene regulation. However, although knockdown of the factors was successful, the immediate effects on gene expression turned out to be minor. In an effort to further investigate the mechanisms that underlie the assumed transcriptional co-regulation, we analyzed the interactome of CHD1 by co-immunoprecipitation (co-IP) experiments as well as affinity-purification of tagged CHD1 coupled to mass spectrometry analysis. However, neither strategy revealed stable complex formation between CHD1 and DOM or Elp3, respectively.