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Titelaufnahme

Titel
The Phospho-regulation of Ascl2 in Homeostatic Stem Cell Maintenance and Differentiation in the Small Intestine
VerfasserDuré, Clara Sophie
Begutachter / BegutachterinnenEdenhofer, Frank ; Philpott, Anna
Betreuer / BetreuerinnenEdenhofer, Frank
Erschienen2018
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Masterarb., 2018
Datum der AbgabeOktober 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Stammzellen / Dünndarm / Krypten / Vili / Ascl2 / Aufrechterhaltung / Organoide / PiggyBac Transposon System
Schlagwörter (EN)stem cells / small intestine / crypts / vili / Ascl2 / maintenance / organoids / PiggyBac transposon system
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-29744 Persistent Identifier (URN)
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The Phospho-regulation of Ascl2 in Homeostatic Stem Cell Maintenance and Differentiation in the Small Intestine [23.33 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung

Der Transkriptionsfaktor Achaete-Scute (Ascl2) aus der Familie der basic Helix-loop- Helix Proteine (bHLH) spielt eine essentielle Rolle für Stammzellen im Dünndarm des Menschen wie auch der Maus. Das Gen Ascl2 kodiert für das Protein Ascl2. Ascl2 hat Einfluss auf die eigene Aktivität durch eine Rückkopplungsschleife, die durch eine basale Aktivierung von Wnt reguliert wird und ermöglicht dadurch ein abgegrenztes Kompartiment für Stammzellen im Darmepithelium. Aus diesem Grund wird Ascl2 als Schlüsselregulator der Determinierung zwischen Proliferation und Differenzierung im Darm angesehen. Die Expression von Ascl2 ist auch in die Tumorbildung von kolorektalen Karzinomen involviert, da Ascl2 die Proliferation von malignen Zellen antreibt. Das bringt die Frage auf, welche Eigenschaften von Ascl2 zur Tumorentwicklung im Darm führen? Verwandte Proteine von Ascl2 zeigen, dass deren biologische Wirkung von deren Phosphorylierungsstatus abhängt. Deswegen wurde in dieser Arbeit folgende zentrale Frage adressiert: Welchen Einfluss hat die Regulation von Ascl2 durch Phosphorylierung auf die homöostatische Aufrechterhaltung von Stammzellen und Zelldifferenzierung im Darm?

Um den Phosphorylierungsstatus von Ascl2 in vitro zu bestimmen, sowie herauszufinden welche Cyclin-abhängigen Kinasen daran beteiligt sind und wie sich dies auf die Proteinstabilität von Ascl2 auswirkt, wurden biochemische Experimente durchgeführt. Um die Effekte von Ascl2 Phosphorylierung zu bestimmen, wurden Darmorganoide der Maus mit einem Doxycyclin-induzierbaren Vektorsystem transferiert, welches die Expression von Wildtyp-Ascl2 beziehungsweise eine nicht- phosphorylierbare Mutante erlaubt.

Die Resultate zeigen, dass Ascl2 hauptsächlich von der Kinase Cdk1/CyclinB phosphoryliert wird und die Inhibierung Cyclin-abhängiger Ascl2 Phosphorylierung sich positive auf Stabilität und Abundanz des Proteins auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass inhibierte Phosphorylierung von Ascl2 zu verschlechtertem Wachstum von Darmorganoiden führt und sogar Abwehrmechanismen auslöst, um die Expression von dephosphoryliertem Ascl2 zu supprimieren. Diese Untersuchungen liefern erste Einblicke in die Rolle von phosphoryliertem Ascl2 bei der Aufrechterhaltung eines Stammzellekompartiments im Dünndarm.

Zusammenfassung (Englisch)

The achaete-scute family bHLH transcription factor 2 (Ascl2) is essential for stem cells in the human as well as the mouse small intestine. The gene Ascl2 is coding for the protein Ascl2. Ascl2 was found to have the ability to self-activate its expression through a feedback loop, which is activated by basal Wnt signalling. By that Ascl2 is capable of maintaining a discrete compartment of stem cells in the intestinal epithelium. Therefore Ascl2 can be considered as a key force of cell fate regulation in the intestine. Ascl2 is known to be involved in colorectal cancer formation by maintaining a proliferative stem cell character in malignant cells. This raises the question what features of Ascl2 expression lead to the formation of malignancies in the intestine?

Related genes of Ascl2 showed that phosphorylation is crucial for their fundamental fate-driving forces in cells. Hence, the role of Ascl2s phosphorylation status became focus of interest: What impact does the phospho-regulation of Ascl2 have on homeostatic stem cell maintenance and differentiation in the small intestine? To examine the role of cyclin-dependent phosphorylated Ascl2 as well as dephosphorylated Ascl2, a human colorectal cancer cell line and intestinal organoids from mice were analysed. Biochemical experiments were conducted to determine the phosphorylation status of Ascl2 in vitro, identifying which cyclin-dependent kinases are involved and to obtain data on phosphorylation-depending protein stability. Organoids were transduced with a tetracycline-inducible vector system, which allows the expression of wild-type Ascl2 and a non-phosphorylatable mutant, respectively, to assess the effects of phosphorylation of Ascl2.

The results demonstrate that Ascl2 is mainly phosphorylated by cyclin-dependent kinase Cdk1/CyclinB. The prevention of cyclin-dependent phosphorylation of Ascl2 increases its stability and abundance exceedingly. Prevention of phosphorylation of Ascl2 in intestinal organoids leads to impaired growth and subsequently causes defence mechanisms in those organoids trying to suppress the expression of dephosphorylated Ascl2. This study provides first insights into the role of phosphorylation of Ascl2 in small intestine stem cell maintenance.

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