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Titelaufnahme

Titel
Evaluation of in vitro and in vivo models to study human fungal pathogens / Elisabeth Maurer
VerfasserMaurer, Elisabeth
Begutachter / BegutachterinHaas, Hubertus ; Buzina, Walter
Betreuer / BetreuerinLass-Flörl, Cornelia ; Binder, Ulrike
Erschienen2014
Umfang160 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeNovember 2014
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Aspergillus spp. / Mucorales / Hypoxie / in vitro Empfindlichkeitstestung / Biomarker Abgabe / alternatives in vivo Modell Galleria mellonella
Schlagwörter (EN)Aspergillus spp. / Mucorales / Hypoxia / in vitro susceptibility testing / biomarker release / alternatibe in vivo model Galleria mellonella
Schlagwörter (GND)Hypoxie / Pathogene Pilze / Opportunistisch-pathogener Erreger / Virulenz
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-1739 Persistent Identifier (URN)
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Evaluation of in vitro and in vivo models to study human fungal pathogens [5.15 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In den letzten Jahrzehnten konnte ein kontinuierlicher Anstieg an invasiven Pilzinfektionen festgestellt werden, welcher hauptsächlich auf die steigende Anzahl an immunsupprimierten Patienten zurückzuführen ist. Zusätzlich ist ein Zuwachs an pathogenen Pilzen mit einer niederen Empfindlichkeit bzw. einer Resistenz gegen Antimykotikas nachgewiesen. Candida- und Aspergillus-Spezies sind die häufigsten opportunistischen Pilzerreger, jedoch ist ein vermehrtes Auftreten von atypischen Pilzpathogenen wie nicht-fumigatus Aspergillus Spezies und Mucorales sichtbar. Angesichts dieser Komplexität an Patienten-Risikofaktoren plus der zunehmenden Vielfalt an unterschiedlichen Pathogenen, bleibt die Diagnose und Therapie eine große Herausforderung.

Um invasive Pilzinfektionen erfolgreich behandeln zu können, ist eine rasche und spezifische Diagnose notwendig. Speziell die Entwicklung von neuen Methoden wie die Detektion von Biomarkern, die nicht auf Kultur basieren, ist notwendig. Gleichzeitig trägt eine Verbesserung von in vitro Empfindlichkeitstestungen zu einer optimierten Therapie bei. Während einer invasiven Pilzinfektion kommt es in der Lunge zu verringerten Sauerstoffkonzentrationen. Der zur Verfügung stehende Sauerstoff kann in der infektiösen Umgebung sogar unter 1% liegen und beeinflusst somit das Pathogen als auch das umgebende Gewebe. Deswegen könnte diese hypoxische Umgebung einen Einfluss auf die Abgabe von Biomarkern, sowie auf die Wirkung von antifungalen Substanzen haben. Standard Methoden zur Empfindlichkeitstestung werden unter atmosphärischen Sauerstoffbedingungen durchgeführt und die antifungale Wirkung wird auf Konidien getestet. In vivo Bedingungen, wie Hypoxie, fließen somit nicht in die Testung ein. Die antifungale Wirkung auf Hyphen kann zudem enorm von der MHK, getestet auf Konidien, abweichen.

In vivo Modelle bekommen immer mehr Relevanz in der Klinik und helfen ein intensiveres Verständnis für den Krankheitsverlauf von invasiven Pilzinfektionen und Therapieoptionen zu bekommen. Die Larve der großen Wachsmotte Galleria melonella bestätigte sich als ein wertvolles alternatives Tiermodel um das Virulenz-Verhalten von verschiedenen Pilzpathogenen, sowie die Effizienz von antifungalen Therapieoptionen zu untersuchen.

Ziel dieser Studie war es (I) den Einfluss von Hypoxie auf die Wirkung von antifungalen Substanzen, sowie die Abgaben von Biomarkern von humanen Pilzpathogenen in vitro zu bestimmen; (II) die Auswirkung von Azolen auf Aspergillus-Hyphen unter hypoxischen Bedingungen zu untersuchen und Einflüsse auf die Sterol-Biosynthese und den mitochondrialen Stoffwechsel zu eruieren; und (III) das alternativen Tiermodels G. mellonella für die Untersuchung des Virulenz-Verhaltens verschiedener A. terreus und Mucorales Stämme, sowie und der Wirksamkeit von verschiedenen antifungalen Substanzen zu etablieren.

Unterschiede in den MHK/MEKs und ECOFFs auf Grund hypoxischer Wachstumsbedingungen sind abhängig von der Testmethode (Etest® oder EUCAST), der Pilzspezies und deren Fähigkeit in Hypoxie zu wachsen. Ein vereinfachtes visuelles Ablesen der MHK/MEK ist unter Hypoxie jedoch erkennbar. Für alle getesteten Pilzspezies war keine Veränderung in der antifungalen Aktivität sichtbar, mit Ausnahme von A. terreus Stämmen, wo eine Veränderung von fungizider zu fungistatischer Wirkung sichtbar war. Hypoxie beeinflusst die Abgabe von Galaktomannan und -(1,3)-Glukan nur in frühen Zeitpunkten (24h), wo eine erhöhte Abgabe detektiert wurde. Zudem führt eine Behandlung mit Antimykotikas unter Hypoxie zu einer geringeren Galaktomannan Abgabe als unter atmosphärischen Bedingungen.

Unter hypoxischen Wachstumsbedingungen wurde eine verringerte Schädigung durch Azole auf Aspergillus-Hyphen detektiert. Zusätzlich konnte eine Veränderung in der Sterol-Biosynthese von A. fumigatus festgestellt werden, welche auf eine verringerte Wirksamkeit von Azolen unter hypoxischen Bedingungen hinweist. Des Weiteren war der mitochondriale DNA-Gehalt in Hypoxie unter Azol-Behandlung erhöht.

Die Verwendung von G. mellonella zur Untersuchung der Virulenz von A. terreus und Mucorales Stämmen, sowie von eventuelle Therapieoptionen erwies sich als ein nützliches alternatives Tiermodell. Galleria mellonella Larven waren sensitive für diese Pilzpathogene in einer dosis- und temperaturabhängigen Weise. Für alle A. terreus Stämme konnte eine Korrelation zwischen der in vitro Empfindlichkeit von Amphotericin B (AMB) und des in vivo Therapieerfolges festgestellt werden. Amphotericin B empfindliche Stämme wiesen ein erhöhtes Virulenz-Potential auf, welches mit schnelleren Wachstum und geringerer Schädigung durch Hämozyten einherging. Zusätzlich führte die Behandlung mit L-AMB zu einer erhöhten Immunantwort, jedoch war diese auf Proteinebene nur marginal sichtbar.

Ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Auftreten und dem Virulenz-Potential von Mucorales Stämmen konnte festgestellt werden. Zusätzlich korrelierte das Virulenz-Potential mit der Fähigkeit zum schnelleren Wachstum. Des Weiteren wurde die antifungale Wirkung von L-AMB, Posaconazol, Isavuconazol und Nystatin-Intralipid untersucht und ein Medikamenten- und Spezies-abhängiger Ausgang konnte festgestellt werden. Um das Überleben der Larven zu sichern, waren jedoch höhere Konzentrationen nötig als jene die in vitro das Pilzwachstum inhibierten.

Zusammenfassung (Englisch)

Invasive fungal infections (IFIs) have increased over the last decades due to the growing number of patients at risk. These are especially immunocompromised patients undergoing treatment against haematological malignancies and those who have received solid organ transplantation. Furthermore, fungal pathogens with diminished susceptibility or complete resistance to antifungal agents are emerging. The epidemiology of IFIs has changed in the recent years and non-fumigatus Aspergillus infections, those of Mucorales and other filamentous fungi have increased. Given this complexity of the patient risk factors and the increasing variety of fungal pathogens, diagnostic and therapy of IFIs remains a big challenge. To improve clinical outcome it is essential to advance diagnosis by development of non-culture based diagnostic assays, and to optimize therapeutic strategies, also with the help of in vitro susceptibility testing. Standard testing methods are performed at atmospheric oxygen levels and antifungal agents are applied to conidia. Currently, these assays do not simulate the situation at site of infection. Hypoxia is one microenvironmental stress occurring during pulmonary fungal infections in vivo, and available oxygen concentrations can decrease to 1% and even lower. These conditions certainly are a challenge for the pathogen and may play a role in the release of biomarkers and in the activity of antifungal agents.

Another strategy for better understanding the in vivo situation during IFIs is the use of animal models. The larvae of the greater wax moth, Galleria mellonella, have been widely used as alternative models to evaluate the virulence of fungal pathogens and the efficacy of antimicrobial drugs.

The aim of this study was (I) to investigate the influence of hypoxia on antifungal drug activity and biomarker release of different human fungal pathogens in vitro; (II) to evaluate the activity of azoles against Aspergillus-hyphae in both oxygen conditions, and to determine changes in the sterol pattern and mitochondrial DNA content; and (III) to establish the invertebrate model G. mellonella to study virulence, efficacy of antifungal therapy in vivo, and its impact on larval immune response.

Summarizing, changes of minimal inhibitory concentrations (MICs) and epidemiological cut offs (ECOFFs) due to hypoxia largely depend on the method of choice (Etest® or microbroth dilution), the species and the ability to grow at hypoxia. Second, a hypoxic environment makes visually reading of MICs/MECs easier. The antifungal activity of the tested agents was not significantly altered in hypoxia for Aspergillus spp. and Mucorales, except for A. terreus, for which activity changed from fungicidal to fungistatic. Furthermore, this study showed, that hypoxia increased the release of galactomannan and -(1,3)-glucan at early growth stages, while no alterations were detected at later timepoints (after 24h). A combination of hypoxic environment and the presence of antifungals led to even more pronounced reduction of GM release than in normoxia.

Application of azoles to fungal hyphae caused less fungal damage in hypoxic growth conditions. Sterol pattern did not change due to hypoxia alone, but when fungi were treated with azoles, changes in amount of ergosterol, eburicol and lanosterol were detected, indicating lower efficacy of azoles in hypoxia. This was further reflected in differentially expression of genes involved in ergosterol biosynthesis. Additionally, a slight increase to higher mitochondrial DNA content was detected during azole exposure in hypoxia.

Further, this study demonstrates that the invertebrate model G. mellonella is a useful tool to study virulence potential of A. terreus and Mucorales strains and to evaluate efficacy of antifungal agents. Larvae were sensitive to infection in an inoculum-size and temperature dependent manner. For A. terreus, in vitro susceptibility to amphotericin B (AMB) correlated with in vivo outcome, defining an AMB susceptible strain cluster of A. terreus. Strains who have been susceptible to liposomal AMB demonstrated increased virulence potential in the larval model, and this increase was in accordance with faster growth and less damage caused by larval haemocytes. Liposomal AMB treatment primed the larval immune response, but differences in the abundance of antimicrobial proteins were marginal.

For Mucorales, pathogenicity in larvae reflected clinical relevance, since Rhizopus arrhizus, Mucor ciricnelloides and Rhizopus microsporus exhibited highest virulence. Virulence potential correlated with strain-dependent physiological attributes, as growth speed and bigger spore size demonstrated to be important factors to cause infection. We evaluated antifungal efficacy of liposomal amphotericin B, posaconazole, isavuconazole and nystatin intralipide in vivo, and were able to demonstrate a drug- and strain dependent outcome. Nevertheless, the antifungal concentration to protect larvae had to be higher than in vitro MICs.