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Titel
The receptor tyrosine kinase FLT3 phosphorylates and inactivates the CDK inhibitor p27Kip1 in acute myeloid leukemia / submitted by Ines Peschel
Weitere Titel
Die Rezeptortyrosinkinase FLT3 phosphoryliert und inaktiviert den CDK-Inhibitor p27Kip1 in akuter myeloischer Leukämie
VerfasserPeschel, Ines
Betreuer / BetreuerinnenHengst, Ludger
ErschienenInnsbruck, March 2018
Umfang134 Seiten : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftMedical University Innsbruck, Dissertation, 2018
Datum der AbgabeMärz 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Zellzyklus / CDK-Inhibitor / p27Kip1 / FLT3 / FLT3-ITD / AML / Rezeptortyrosinkinase / Tyrosinkinase / Tyrosinkinaseinhibitor
Schlagwörter (EN)cell cycle / CDK-inhibitor / p27Kip1 / FLT3 / FLT3-ITD / AML / receptor tyrosine kinase / tyrosine kinase / tyrosine kinase inhibitor
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-31666 Persistent Identifier (URN)
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The receptor tyrosine kinase FLT3 phosphorylates and inactivates the CDK inhibitor p27Kip1 in acute myeloid leukemia [12.15 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der CDK-Inhibitor p27 spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Zellzyklusprogression. Phosphorylierung an Tyrosin 88 (pY88) von p27 macht jedoch aus dem Tumorsuppressor p27 ein potentielles Onkogen indem die Aktivität der an p27 gebundenen CDK Kinasen reaktiviert wird, was zu einer Komplexbildung und Aktivierung von Cyclin-CDKs und einen verstärkten Skp2-abhängige Abbau von p27 führt.

In dieser Studie deckten wir einen direkten Zusammenhang zwischen Rezeptortyrosinkinasen und der Regulation von p27 durch diesen Mechanismus auf. Wir zeigten, dass Mitglieder der PDGFR-Familie einschließlich FLT3, FLT3-ITD, PDGFR, PDGFR und dem onkogenen Fusionsprotein FIP1L1-PDGFR p27 an Y88 phosphorylieren können. FLT3 ist das am häufigsten mutierte Gen bei AML, da etwa 30% der Patienten entweder “internal tandem duplications (ITD)” oder Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne tragen.

Wir konnten zeigen, dass FLT3 und FLT3-ITD p27 direkt binden und an Y88 phosphorylieren können. Pull-down Experimente zeigten eine starke und spezifische Bindung zwischen FLT3 und p27, vor allem zwischen dem N-Lobus der Tyrosinkinasedomäne von FLT3 und der N-terminalen Kinase-inhibitorischen Domäne von p27. Stimulation von FLT3 WT exprimierenden Zelllinien mit dem spezifischen FLT3-Liganden (FL) steigerte die Y88-Phosphorylierung von p27, während die Hemmung von FLT3-ITD in AML Zelllinien die p27-Y88 Phosphorylierung reduzierte. Gleichzeitig stiegen die p27 Proteinlevel nach FLT3-Inhibition an, höchstwahrscheinlich, weil unphosphoryliertes p27 durch verminderte Skp2-abhängige Degradation stabiler ist.

p27-Y88 Phosphorylierung konnte auch erstmals in primären AML Patientenproben detektiert werden. Inaktivierung von FLT3 mit AC220/Quizartinib, einem hochspezifischen FLT3-Inhibitor, reduzierte pY88-p27 in Zellen von FLT3 WT positiven Patienten und in 5 von 9 FLT3-ITD exprimierenden Patientenproben. Überraschenderweise stieg jedoch pY88-p27 nach AC220-Behandlung in 4 FLT3-ITD positiven AML Patientenproben an, weshalb andere hochaktive Tyrosinkinasen p27 an Y88 ebenfalls phosphorylieren könnten. Tatsächlich fanden wir, dass in diesen Patienten Src-Familie Tyrosinkinasen (SFKs) zur p27-Y88 Phosphorylierung beitragen, da die Behandlung mit dem SFK-Inhibitor Dasatinib den Phosphorylierungsstatus von p27 reduzieren konnte.

Zusammenfassend zeigten wir einen neuen Weg, wie FLT3 über die Y88 Phosphorylierung von p27 zur Hyperproliferation von leukämischen Zellen in AML beitragen kann. p27 Proteinlevel und pY88-p27 könnten als Prognosemarker in AML oder anderen Krebsarten mit hoher Tyrosinkinaseaktivität dienen. Außerdem könnte pY88-p27 als prädiktiver Marker für Therapieentscheidungen mit Tyrosinkinaseinhibitoren (TKIs) verwendet werden und als Biomarker, um frühzeitig Resistenzen gegen TKI-Therapien erkennen zu können.

Zusammenfassung (Englisch)

The CDK-inhibitor p27Kip1 plays a major role in regulating cell cycle progression. However, phosphorylation on tyrosine residue 88 (pY88) of p27 converts the tumour suppressor p27 to a potential oncogene by reactivating the p27-bound CDK kinase activity, leading to cyclin-CDK assembly, activation and an increased Skp2-dependent proteasomal degradation of p27.

In this study, we uncovered a direct link between receptor tyrosine kinases and the regulation of p27 by this mechanism. We demonstrated that members of the PDGFR family including FLT3, FLT3-ITD, PDGFR, PDGFR and the oncogenic fusion protein FIP1L1-PDGFR can phosphorylate p27 on Y88. FLT3 is the most frequently mutated gene in AML with about 30% of patients carrying activating internal tandem duplications (ITD) or point mutations in the tyrosine kinase domain.

We observed that FLT3 and FLT3-ITD bind and phosphorylate p27 directly on Y88. Pull-down experiments revealed a strong and specific interaction between FLT3 and p27, in particular between the N-lobe of the tyrosine kinase domain (TKD1) of FLT3 and the N-terminal kinase-inhibitory domain of p27. Stimulation of human FLT3 WT expressing cell lines with the specific FLT3 ligand (FL) increased Y88-phosphorylation of p27 whereas inhibition of FLT3-ITD in AML cell lines strongly reduced p27-Y88 phosphorylation. In parallel, p27 protein levels increased after FLT3 inhibition, most probably because unphosphorylated p27 is more stable due to impaired Skp2-dependent degradation.

Importantly, for the first time, p27-Y88 phosphorylation could also be detected in primary patient samples. In AML patients, inactivation of FLT3 with AC220/Quizartinib, a highly specific FLT3 inhibitor, significantly reduced pY88-p27 in cells obtained from FLT3 WT positive patients and in 5 of 9 FLT3-ITD expressing patient samples. Surprisingly however, pY88-p27 increased upon AC220 treatment in 4 FLT3-ITD positive AML patient samples, indicating that other highly active tyrosine kinases might also phosphorylate p27 on Y88. Actually, we found Src family kinases (SFKs) to contribute to p27-Y88 phosphorylation in these patient samples, since treatment with the SFK inhibitor dasatinib could decrease the phosphorylation status of p27.

Taken together, we uncovered a novel pathway how FLT3 can contribute to hyperproliferation of leukemic cells in AML via Y88 phosphorylation of p27. p27 protein levels and pY88-p27 might serve as prognostic markers in AML and other types of cancer with high tyrosine kinase activity. Furthermore, pY88-p27 might be used as a predictive biomarker for therapy decisions with tyrosine kinase inhibitors (TKIs) and as a drug-monitoring marker to early detect resistance against TKI therapies.

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