Titelaufnahme

Dendritische Zellen (DCs) mediieren das Zusammenspiel von angeborener und erworbener Immunität und spielen somit eine Schlüsselrolle im Immunsystem. Ihre Hauptaufgabe liegt in der Aufnahme und Prozessierung von Krankheitserregern, gefolgt von der Präsentation der Antigene. Sie entwickeln sich ursprünglich aus hämatopoetischen Stammzellen und benötigen für ihre Differenzierung spezifische Zytokinsignale. Die Langerhans Zell- (LCs) Entwicklung erfolgt Transforming-growth-factor- (TGF) abhängig, während konventionelle (cDCs) und plasmazytoide (pDCs) DCs unter dem Einfluss von Fms-like tyrosine kinase 3- (Flt3) Ligand (Flt3-L) differenzieren. Eine präzise Regulierung der intrazellulären Signalwege ist in diesem Zusammenhang von maßgeblicher Bedeutung. Der „spät endosomale/lysosomale Adapter und MAPK und mTOR Aktivator 2“ (LAMTOR2) ist als Komponente des LAMTOR/Ragulator Komplexes entscheidend an der Aktivierung des ERK- und mTORC1-Signalweges am späten Endosomen beteiligt. Des Weiteren reguliert LAMTOR2 den intrazellulären Rezeptortransport, sowie den endosomalen Vesikeltransfer und die Gewebshomeostase.

In meiner Doktorarbeit wurde ein CD11c-spezifisches knock-out Mausmodel etabliert, um die Funktion von LAMTOR2 für das Dendritische Zellsystem zu untersuchen. Die CD11c LAMTOR2del Mäuse waren viabel, entwickelten aber einen DC-spezifischen, pathologischen Phänotyp. Einerseits kam es sechs Tage nach der Geburt zu einem massiven Verlust an Langerin+-migratorischen DCs, wovon besonders die LC Population betroffen war. Gründe dafür könnten eine erhöhte Anzahl apoptotische LCs sowie ein Defekt während der Zellteilung sein. Zusätzlich konnte im Langerin LAMTOR2del Mausmodel eine reduzierte Lokalisation von TGFRII an der Zellmembran nachgewiesen werden. Der Verlust des LC Netzwerkes kurz nach der Geburt in CD11c LAMTOR2del Mäusen war schlussendlich auch auf eine Inhibierung zweier proliferativer Signalwege, ERK und mTORC1, zurückzuführen. Die Deletion von LAMTOR2 führte zu einer Instabilität des gesamten LAMTOR-Komplexes und verhinderte dadurch die spät-endosomale Aktivierung dieser beiden Signalwege.

Ab einem Alter von etwa 3 Monaten entwickelten die CD11c LAMTOR2del Mäuse zusätzlich eine myeloproliferative Erkrankung (MPD). Zu den auffälligsten Veränderungen zählten hierbei stark vergrößerte Milz und Lymphknoten. Beide Organe wiesen durch massive DC-Infiltrate auch morphologisch strukturelle Veränderungen auf. Als Ursachen der Infiltrate konnten eine erhöhte Proliferation von cDCs und pDCs, sowie eine neu erscheinende CD11c + MHCII+ PDCA-1int Zellpopulation identifiziert werden. Diese infiltrierenden LAMTOR2-deletierten DCs wiesen zudem eine höhere Expression von Aktivierungsmarkern wie CD86, MHC-Klasse II und PD-L1 an der Zelloberfläche aus, was zu einer vermehrten Aktivierung des CD4+ T-Zellkompartments führte. Während Serumanalysen unbehandelter CD11c LAMTOR2del Mäuse keine systemische Entzündung anzeigten, führte die Stimulation isolierter LAMTOR2 deletierter cDCs und pDCs zu einer erhöhten Ausschüttung DC-spezifischer, pro-inflammatorischer Zytokine. Außerdem wurden erhöhte Serumwerte für den Differenzierungsfactor Flt3-L gemessen, während dessen Rezeptor an der Zelloberfläche von LAMTOR2-deletierten Milz-DCs akkumulierte. Signalwegsanalysen bestätigten in knock-out Milz DCs, als auch in Flt3-L generierten Knochenmarks DCs (BMDCs) eine Reduktion der ERK-Aktivierung. Unerwarteter Weise wurde die mTORC1-Signalkaskade jedoch nicht inhibiert, sondern verstärkt aktiviert, was die massive DC-Expansion erklären könnte. Die Behandlung der CD11c LAMTOR2del Mäuse mit Rapamycin und AC220, einem spezifischem Flt3-Hemmer, konnte die Symptome kurieren und führte zu einer Verminderung des Schweregrads der myeloproliferativen Erkrankung.

Zusätzliche Experimente befassten sich mit dem Migrationspotenzials von GM-CSF-generierten BMDCs in Richtung eines MIP3-Lockstoffgradientens. Interessanterweise, verringerte der Verlust von LAMTOR2 die adhäsionsabhängige Migration der Zellen durch einen Transwellfilter. Im Gegensatz dazu, war die Migrationsfähigkeit der LAMTOR2-deletierten BMDCs in einem 3D-Versuchsansatz nicht beeinflusst.

Zusammenfassend zeigt meine Doktorarbeit, dass LAMTOR2 eine wichtige regulatorische Rolle für die Kontrolle der DC-Homäostase spielt und dabei insbesondere für das Feinjustieren von Signalkaskaden und des intrazellulären Rezeptortransports verantwortlich ist. Die Entdeckung, dass LAMTOR2-Verlust zu einer erhöhten Aktivierung des mTORC1-Signalwegs führt, war überraschend und bedarf weiterer detaillierter Untersuchungen.

Dendritic cells (DCs) are key players of the immune system and link innate to adaptive immunity. Their main task is the incorporation and processing of pathogens and subsequent presentation of antigens. They originate from hematopoietic stem cells (HSCs) and depend on specific cytokines during their differentiation. While Langerhans cell (LC) differentiation depends on transforming growth factor beta (TGF), conventional (cDCs) and plasmacytoid (pDCs) DCs are dependent on Fms-like tyrosine kinase 3- (Flt3) ligand (Flt3-L). Thus, a tight regulation of receptor signaling is required. The late endosomal/lysosomal adaptor and MAPK and mTOR activator 2 (LAMTOR2), as a component of the LAMTOR/Ragulator complex, is crucial for ERK and mTORC1 activation on the late endosome and is required to control endosomal receptor traffic, endosomal biogenesis and tissue homeostasis.

In my thesis, I intended to investigate the effect of LAMTOR2 on DC homeostasis and function by the use of mice with a CD11c-specific LAMTOR2 deletion. The CD11c LAMTOR2del mice were viable but developed a pathological phenotype, which severely affected DC homeostasis. As early as 6 days after birth these mice showed a massive loss of Langerin+ migratory DCs especially affecting the LC compartment. This was caused by increased apoptosis, impaired proliferation due to cell cycle arrest and, as observed for Langerin LAMTOR2del mice, by reduced TGFRII surface expression. On the molecular basis, an explanation for the observed phenotype could be the inhibition of two proliferative pathways in GM-CSF-generated bone marrow-derived DCs (BMDCs). ERK as well as mTORC1 activation was reduced due to loss of LAMTOR2 and subsequent LAMTOR complex instability.

At a later stage of approximately 3 months, CD11c LAMTOR2del mice developed a myeloid proliferative disorder (MPD). The most obvious morphological symptoms included enlarged lymph nodes and splenomegaly. The structural morphology of these organs was disarranged and massive DC infiltrates were observed. This was explained by increased proliferation of cDCs and pDCs as well as the appearance of a novel population of CD11c + MHCII+ PDCA-1int cells. LAMTOR2 deleted DCs showed increased surface levels of activation markers like CD86, MHC-class II or PD-L1. This probably resulted in an activation of the CD4+ T cell compartment. Toll-like receptor-9 (TLR9) stimulation of isolated cDCs and pDCs led to increased pro-inflammatory cytokine secretion by LAMTOR2 deleted DCs, while steady state serum analysis revealed no systemic inflammation. Interestingly, Flt3-L serum levels were increased and an accumulation of the Flt3 receptor on the surface of knockout splenic DCs could be observed. Downstream signaling analysis revealed an expected decrease of ERK activation in splenic DCs as well as in Flt3-L-generated BMDCs of CD11c LAMTOR2del mice. However unexpectedly, mTORC1 activation downstream of Flt3 was not shut off, but rather boosted, resulting in DC expansion. In vivo treatment of the CD11c LAMTOR2del mice with Rapamycin and AC220, a Flt3 kinase inhibitor, reverted the symptoms and led to a remission of the MPD.

In additional experiments, the migratory capacity of GM-CSF-generated DCs towards a MIP3 gradient was investigated. Interestingly, the loss of LAMTOR2 reduced the adhesion mediated migration through a Transwell filter while integrin-independent migration through 3D environments was not impaired.

I summary, my thesis unraveled that LAMTOR2 plays a pivotal role in regulating DC homeostasis by fine-tuning signaling and receptor trafficking. The finding that loss of LAMTOR2 results in increased activation of mTORC1 downstream of Flt3, was completely unexpected and needs further investigation.