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Titelaufnahme

Titel
Solid-Phase extraction methods for the isolation of natural bioactive substances of plant origin / by Shah Hussain
VerfasserHussain, Shah
Betreuer / BetreuerinBonn, Günther K.
Erschienen2014
UmfangXXIII, 131 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Enth. u.a. 4 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2013 - 2014
Datum der AbgabeNovember 2014
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Festphasenextraktion / Natürlichen bioaktiven Substanzen / Phenolsäuren / Thionine / Menschlichen Plasma / Zirkoniumsilikat / Bismut Zitrat / Aluminiumsilikat
Schlagwörter (EN)Solid-phase extraction / Natural bioactive substances / Phenolic acids / Thionins / Human plasma / Zirconium silicate / Bismuth citrate / Aluminum silicate
Schlagwörter (GND)Fest-Flüssig-Extraktion / Thionin / Phenolcarbonsäuren / Bioaktive Verbindungen
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-1294 Persistent Identifier (URN)
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Solid-Phase extraction methods for the isolation of natural bioactive substances of plant origin [4.3 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Substanzen, die auf lebenden Zellen Aktivität zeigen, werden als bioaktive Verbindungen angesehen. Diese Substanzen können natürlich auftreten (natürliche bioaktive Substanzen) oder synthetisiert werden. Natürlich auftretende bioaktive Substanzen zeigen zahlreiche pharmakologische Aktivitäten und haben ihren Ursprung in Pflanzen, Tieren und Mineralien. Sie können breit gefächert in Proteinen, Kohlenhydraten, Mineralien, Terpenen, Flavonoiden, Phenolsäuren, Vitaminen, Lipide, Saponinen, ect. gefunden werden. Da sie häufig in pflanzlichem und tierischem Gewebe gefunden werden, benötigt man hierfür hochselektive Isolationsmethoden, um ihre Wirksamkeit zu nutzen. Diese Arbeit berichtet über hochselektive Festphasenextraktionsmethoden (solid-phase extraction; SPE) für einige der wichtigsten bioaktiven Substanzen, wie z. B. Phenolsäuren und Thionine, aus ihren natürlichen Quellen. Außerdem wurde die Bioanalyse von Phenolsäuren und ihr Metabolismus im menschlichen Plasma beschrieben.

Phenolsäuren wurden aus Galphimia glauca und Arnicae flos unter Einsatz von reinem Zirkoniumsilikat und Bismut Zitrat Pulver, zwei neuartige SPE-Materialen, extrahiert. Die Leistungsfähigkeit der beiden SPE-Materialen wurde unter Verwendung von high performance liquid chromatography mit diode-array detection (HPLC-DAD) mit den am häufigsten angewandten kommerziell erhältlichen stationären Phasen verglichen. Die Art der Wechselwirkung zwischen dem Trägermaterial und dem Säure-Zielmolekül wurde durch Untersuchungen von Silica, C18, Oasis® MAX und Zirkoniumsilikat erforscht.

Die anderen untersuchten bioaktiven Substanzen waren kleine Thionine (ca. 5kDa), reich an Cystein, und basischen Proteinen, vorkommend im Pflanzenreich. Es wurde eine effiziente SPE Methoden für die selektive Isolation von Thioninen entwickelt. Hohlraum monolithische Extraktionsspitzen auf Basis von Polystyrol-co-divinylbenzolmit eingebettetem Zirkoniumsilikat- Nanopulver und Aluminiumsilikat-Pulver in Extraktionssäulen wurden als zwei neue SPE-Materialen verwendet.

Für die selektive Isolierung von Viscotoxinen, Purothioninen und Hordothioninen wurden europäische Mistel-, Weizen- und Gerste Proben verwendet. Die isolierten Fraktionen wurden einer Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation „time-of-flight“ Massenspektrometrie (MALDI / TOF-MS) unterzogen.

Für die Peptidmassenfingerprint -Analyse wurde eine tryptische Verdauung von SPE-Eluaten durchgeführt. HPLC-DAD wurde für die Reinigung der einzelnen Isoformen verwendet.

Eine effizientes SPE Reinigungsverfahren für die Bioanalyse der Phenolsäuren und deren Metaboliten aus humanem Plasma wurde ebenfalls durchgeführt. Methanol Deproteinierung wurde angewandt, gefolgt von Zirkonsilikat unterstütztem Ausschluß der Restproteinen. Es wurde MALDI / TOF MS für die Überwachung der Proteine während des Reinigungsprozesses an den menschliche Plasmaproben angewendet.

Die Proteine wurden durch kolorimetrische Detektion unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA)-Assays quantifiziert. Die analytische Strategie verursacht den Abbau von > 99,6% Proteinen aus den menschlichen Plasmaproben. Darüber hinaus wurde HPLC-DAD und Elektrospray-Ionisation mit massenspektrometrischer Detektion (ESI MS) für die Bioanalytik der Phenolsäuren und deren Metaboliten angewandt.

Das vorgestellte System verbessert die Reinigungswirksamkeit der Methanol Deproteinierung, verkürztsignifikant die Matrixeffekte und zeigt hohe Ausbeuten für Analyten.

Die entwickelten SPE Strategien bieten eine analytische Plattform für die selektive Isolierung von natürlichen bioaktiven Substanzen aus den komplexen Proben. Die vorgestellten Techniken können die Suche nach neuen Quellen für diese pharmakologischen Wirkstoffe unterstützen. Darüber hinaus kann das vorgestellte Reinigungsschema verwendet werden, um die Pharmakokinetik von bioaktiven Substanzen zu untersuchen.

Zusammenfassung (Englisch)

Substances demonstrating activity on living cells are considered to be bioactive. These substances can occur naturally (natural bioactive substances) or they can be synthesized. Demonstrating numerous pharmacological activities, natural bioactive substances originate from plants, animals, and minerals. These can be found broadly as: proteins, carbohydrates, minerals, terpenes, flavonoids, phenolic acids, vitamins, lipids, saponins etc. As they are often found in plant or animal tissues, therefore, highly selective isolation methods are required to exploit their effectiveness. The thesis reports highly efficient solid-phase extraction (SPE) methods for some of the important bioactive substances i.e., phenolic acids and thionins from their natural sources. Moreover, bioanalysis of phenolic acids and their metabolites from human plasma has also been described.

Phenolic acids were extracted from Galphimia glauca and Arnicae flos employing pure zirconium silicate and bismuth citrate powders as two novel sorbents. The efficiency of both the sorbents was compared to the most commonly applied commercially available stationary phases by using high performance liquid chromatography hyphenated to diode-array detection (HPLC-DAD). The nature of interaction between the carrier sorbent and the acidic target molecules was investigated by studying silica, C18, Oasis® MAX and zirconium silicate.

The other bioactive substances studied were thionins, which are cysteine rich, small (5 kDa) and basic proteins occurring in the plant kingdom. Efficient SPE methods for the selective isolation of thionins were developed. Hollow-monolithic extraction tips based on poly(styrene-co-divinylbenzene) with embedded zirconium silicate nano-powder and aluminum silicate powder in extraction columns were employed as two novel sorbents. European mistletoe, wheat and barley samples were used for selective isolation of viscotoxins, purothionins and hordothionins, respectively. The isolated fractions were subjected to matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometery (MALDI/TOF MS). For peptide mass-fingerprint analysis tryptic digests of SPE eluates were performed. HPLC-DAD was employed for the purification of individual isoforms.

An efficient SPE clean-up method for the bioanalysis of phenolic acids and their metabolites from human plasma was also reported. Methanol deproteinization was applied, followed by zirconium silicate assisted exclusion of residual proteins. MALDI/TOF MS was used for monitoring the proteins during clean-up practice applied to human plasma samples. The proteins were quantified by colorimetric detection using the bicinchoninic acid (BCA) assay. The analytical strategy caused the depletion of >99.6% proteins from human plasma samples. Furthermore, HPLC-DAD and electrospray ionization mass spectrometric detection (ESI MS) was applied for the bioanalysis of the phenolic acids and their metabolites. The presented scheme improved the clean-up efficacy of the methanol deproteinization, significantly reduced the matrix effects and demonstrated high recoveries for analytes.

The developed SPE strategies provide an analytical platform for the selective isolation of natural bioactive substances from the complex samples. The presented techniques can aid the quest for the new sources of these pharmacological active compounds. Moreover, the presented clean-up scheme can be employed to study the pharmacokinetics of bioactive substances.