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Titelaufnahme

Titel
Structural and functional characterization of the major birch pollen allergen Bet v 1 / eingereicht von Sarina Grutsch
VerfasserGrutsch, Sarina
Begutachter / BegutachterinTollinger, Martin ; Konrat, Robert
Betreuer / BetreuerinTollinger, Martin
Erschienen2014
UmfangIV, 242 Bl. : zahlr. Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeOktober 2014
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Hauptallergen der Birke Bet v 1 / Kernspinresonanzspektroskopie / Dynamik / Proteinstruktur / Ligandenbindung / Allergenizität
Schlagwörter (EN)Major birch pollen allergen Bet v 1 / Nuclear magnetic resonance spectroscopy / Dynamics / Protein structure / Ligand binding / Allergenicity
Schlagwörter (GND)Hängebirke / Ligand <Biochemie> / Allergen / Chemische Struktur / NMR-Spektroskopie
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-1527 Persistent Identifier (URN)
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Structural and functional characterization of the major birch pollen allergen Bet v 1 [25.15 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Ziel dieser vorliegenden Doktorarbeit war die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Hauptallergens der Hänge-Birke (Betula verrucosa), Bet v 1.

Bet v 1 gehört zur Familie der „pathogenesis-related“ Klasse 10 Proteine (PR-10) und ist Hauptauslöser von Typ 1 Allergien. Die typische PR-10 Proteinfaltung besteht aus einem siebensträngigen, antiparallelen -Faltblatt, das sich um eine C-terminale -Helix windet und dadurch einen internen, amphiphilen Hohlraum bildet. Dieser Hohlraum ermöglicht das Binden zahlreicher, kleiner Ligandenmoleküle. Die physiologische Aufgabe von Bet v 1 in Pflanzen liegt in der Bindung, in der Speicherung und im Transport von lipidischen Pflanzenmediatoren. Es ist bekannt, dass das Liganden-Binden an Bet v 1 dessen Allergen-induzierte Immunantwort drastisch verändert. Daher wird eine weitaus komplexere Funktion dieses Proteins angenommen. In struktureller Hinsicht aber ist der Mechanismus wie Liganden den hydrophoben Hohlraum erreichen nicht bekannt, da vor allem die Öffnungen zum Hohlraum zu klein sind für das Passieren der Liganden. Zudem fehlt eine Erklärung warum verschiedene Bet v 1 Isoformen, die nur geringe Unterschiede in deren dreidimensionalen Strukturen aufweisen, trotzdem markant auffallend unterschiedliche, immunologische Eigenschaften besitzen.

Diese Doktorarbeit trägt somit nicht nur zum besseren Verständnis des Ligand-Bindungsmechanismus bei sondern bietet auch ein umfassendes Bild über das Zusammenspiel von Struktur, Dynamik und Funktion des Bet v 1 Allergens.

Das erste Projekt beschäftigt sich mit der Optimierung der Proteinexpression und Proteinreinigung. Im Speziellen werden die Protokolle für die Herstellung selektiv-markierter Proteine, wie sie bei NMR spektroskopischen Studien benötig werden, verbessert. Des Weiteren werden im Rahmen dieser Arbeit zwei genetisch modifizierte Bet v 1 Proteinmutanten generiert.

Der Hauptteil der Arbeit beschäftigt sich mit der Proteindynamik unterschiedlicher Bet v 1 Isoallergene. NMR Relaxationsexperimente und computerunterstütze Untersuchungen liefern Informationen über die konformationelle Dynamik der Proteine auf unterschiedlichen Zeitskalen. Unsere Daten zeigten eine konformationelle Heterogenizität des Bet v 1 Proteins in Lösung. Zudem wurde gezeigt, dass verschiedene Bet v 1 Allergene unterschiedliche, dynamische Eigenschaften aufweisen. Eine Korrelation zwischen konformationeller Stabilität und Allergenizität wurde beobachtet.

Ein weiteres Projekt behandelte den Bindungsmechanismus des Bet v 1 Proteins. Interaktionsseiten sowie Bindungsaffinitäten von verschiedenen Ligandmolekülen konnten durch eine Kombination von isothermaler Titrations-Kalorimetrie, kristallografischen und NMR spektroskopischen Untersuchungen bestimmt werden. Zwei natürlich vorkommende Liganden, Jasmonsäuremethylester und Lipoteichonsäure, wurden im Rahmen dieser Arbeit identifiziert. Des Weiteren wurde eine gewisse Spezifität für Ligandenmoleküle entdeckt. In diesem Zusammenhang konnten Unterschiede im Bindungsverhalten verschiedener Bet v 1 Isoformen herausgearbeitet werden. Zudem wurde eine signifikante Erstarrung des Proteinrückgrates sowie eine Verdichtung in der Proteinstruktur nach Ligandenbindung beobachtet.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine Korrelation zwischen Allergenizität, Dynamik und Ligand-Bindungsverhalten verschiedener Bet v 1 Proteine besteht: geringe Allergeniziät korreliert mit hoher struktureller Dynamik. Diese dynamischen Prozesse sind wiederum wichtig für die Ligandenbindung. Durch die Bindung des Liganden kommt es dann zu einer signifikanten Reduktion der konformationellen Dynamik. Folglich liefert diese Doktorarbeit eine Erklärung für die beobachten Unterschiede immunogener sowie allergener Eigenschaften von Bet v 1 Proteinen. Die präsentieren Ergebnisse tragen nicht nur fundamental zum molekularen Verständnis bei wie Allergene eine Immunantwort auslösen, sondern liefern auch wichtige Erkenntnisse bezüglich des Ligand-Bindungsmechanismus, der dann wiederum die Immunantwort modulieren kann.

Zusammenfassung (Englisch)

The aim of this thesis was the structural and functional characterization of the major birch pollen allergen, Bet v 1 (Betula verrucosa).

Bet v 1 belongs to the pathogenesis-related class 10 protein family (PR-10) and represents the main cause for type I allergies. A typical PR-10-fold contains a seven-stranded, antiparallel -sheet that wraps around a long C-terminal -helix, thereby forming an amphiphilic internal cavity, which is capable of binding a variety of small ligand molecules. The physiological role of Bet v 1 in plants most likely involves binding, storage and transport of lipidic plant mediators. As it is well known that ligand binding drastically modulates allergen-induced immune response, a more complex function of Bet v 1 to induce an allergic reaction has been assumed. From a structural point of view, however, it is not clear how ligands enter the hydrophobic cavity, as the entry-tunnels are too small for ligand passage. Furthermore, an explanation why different Bet v 1 isoforms that display very little variation in their three-dimensional structure have strikingly different immunological properties was missing.

This thesis not only contributes to a better understanding of the ligand binding mechanism but also presents a comprehensive picture of the interplay between structure, dynamics and function of Bet v 1 allergens.

One part of this thesis covered the optimization of protein over expression and purification, especially for (selectively) isotope labeling of allergens suitable for NMR spectroscopic studies. Moreover, two genetically modified Bet v 1 proteins were generated.

The main part of this thesis concerned the dynamics of different Bet v 1 isoforms. NMR relaxation experiments and computational analyses provided information about conformational flexibility on different time scales. The data showed that Bet v 1 is conformationally heterogeneous in solution and that various Bet v 1 isoallergens exhibit different dynamic behaviors. A correlation between conformational stability and allergenicity was observed.

A second project focused on the ligand binding mechanism of Bet v 1. Interaction sites and binding affinities for various small molecules were determined using a combination of isothermal titration calorimetry, crystallographic and NMR spectroscopic studies. Two naturally occurring ligands, namely methyl jasmonate and lipoteichoic acid were identified. Moreover, a certain specificity for ligand molecules of Bet v 1 proteins was observed and differences in binding properties between various Bet v 1 isoforms were found. Additionally, upon ligand binding, a significant rigidification of the protein backbone, along with a compaction of the protein structure was observed.

In summary, the results of this thesis reveal a correlation between allergenicity, dynamics and ligand binding behavior of Bet v 1 allergens: low allergenicity is related to high structural dynamics. These dynamic processes are crucial for ligand binding and a significant reduction in conformational dynamics accompanies the binding event. Therefore, a rationale for the observed differences in the immunogenic and allergenic properties of Bet v 1 proteins is provided.

The presented results not only contribute fundamentally to understand the basic mechanism of how allergens trigger allergy, but also provide information about ligand binding mechanisms of allergens that can in turn modulate the immune response.