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Titelaufnahme

Titel
Coupling capillary electrophoresis to mass spectrometry for protein and proteome analysis / by Klaus Faserl
VerfasserFaserl, Klaus
Begutachter / BegutachterinBrosch, Gerald ; Rizzi, Andreas
Betreuer / BetreuerinLindner, Herbert
Erschienen2014
Umfang119 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Enth. u.a. 3 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2011 - 2013 . - Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeSeptember 2014
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Kapillarelektrophorese / Massenspektrometrie / CE-MS / Protein Analytik / Proteomik / Histone / posttranslationale Modifikationen / Hefeproteome / SILAC
Schlagwörter (EN)capillary electrophoresis / mass spectrometry / CE-MS / proteomics / histones / post-translational modifications / yeast proteome / SILAC
Schlagwörter (GND)Kapillarelektrophorese / Massenspektrometrie / Proteomanalyse
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-1681 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Coupling capillary electrophoresis to mass spectrometry for protein and proteome analysis [26.28 mb]
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Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Da die Anforderungen an die Analytik in Bezug auf Sensitivität der Messung und Komplexität der Analyten ständig zunehmen, wird seit Jahren an Alternativen zur Kopplung von Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie gesucht. Aus diesem Grund wurde von uns ein Interface zur Kopplung von Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie mitentwickelt sowie die praktische Anwendbarkeit im Labor bewiesen.

Die ersten Forschungsergebnisse mit diesem neuen Interface konnten bereits im Jahr 2011 im höchstdotierten analytischen Journal „Analytical Chemistry“ von uns präsentiert werden. Das Interface und die dadurch mögliche alternative Gerätekopplung bestechen durch eine außerordentliche Sensitivitätssteigerung und zeigen neue Möglichkeiten für die Separierung, Quantifizierung und Strukturaufklärung nicht nur von kleinen Biomolekülen wie Peptiden sondern auch von Proteinen auf.

Dies hat uns auch veranlasst diese Technik zur Untersuchung von Histonen und deren post-translationalen Modifikationen einzusetzen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in „Molecular & Cellular Proteomics“ publiziert, wo wir zeigen konnten, dass es mit dieser neuen Technologie möglich ist Mikro-Sequenzvarianten von Histonen und deren modifizierte Formen hocheffizient zu charakterisieren und zu quantifizieren. Im Zuge dieser Untersuchung wurden auch eine Anzahl neuer Histonmodifizierungen zum ersten Mal beschrieben. Dies ist insofern von Bedeutung, da bekanntlich das Zusammenspiel verschiedener posttranslationaler Modifikationen an Histonen die Genregulation synergetisch oder antagonistisch beeinflussen kann. Die vielseitige Anwendbarkeit dieser Methode erlaubt es somit epigenetische Studien effizienter durchzuführen, aber auch sensitiv und rasch Modifizierungen von Proteinen im Detail zu analysieren.

Der dritte Forschungsartikel beschreibt die Verwendung von Kapillarelektrophorese gekoppelt an die Massenspektrometrie für die relative Quantifizierung zweier Hefeproteome. Für die elektrophoretische Trennung wurde eine neutral beschichtete Kapillare verwendet, jene Beschichtung die sich im zweiten Forschungsteil als optimal für komplexe Peptidgemische herausgestellt hatte. Diese Beschichtung ermöglicht die bestmögliche Auftrennung der Analyten, führt aber zu einer Reduktion der Fließgeschwindigkeiten innerhalb der Kapillare auf ca. 10 nL/min. Das neue Interface hat sich hierbei als äußerst hilfreich erwiesen, da es selbst unter diesen ultra low-flow Bedingungen einen stabilen Elektrospray erhalten kann. Das Ergebnis war eine deutlich erhöhte Sensitivität, die sich in einer massiven Zunahme an identifizierten und quantifizierten Proteinen niederschlug. Die Streuung der quantitativen Messwerte, die zur Berechnung der Proteinverhältnisse dienten, war deutlich geringer, was zu einer präziseren Quantifizierung von Proteinen, insbesondere von niedrig abundanten, führte. Zudem konnten wir eine Vielzahl an Phosphopeptiden identifizieren und Änderungen im Grad der Phosphorylierung quantifizieren.

Insgesamt haben sich das Interface und die Kopplung von Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie vorzüglich bewährt. Das neue System erlaubt eine sensitive Messung und präzise Quantifizierung von Analyten und bietet somit eine echte Alternative zu der konventionellen Kopplung von Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie mit dem Vorteil, dass die Analysenzeiten sehr einfach der Komplexität der Probe angepasst werden können. Mögliche Reste vorhergehender Proben können binnen weniger Minuten vollständig aus dem System entfernt werden und beeinflussen somit nicht die Ergebnisse spätere Analysen. Das System ist vollständig automatisiert und lässt die sequentielle Analyse mehrerer Proben zu. Zudem ist der Verbrauch an Probe verschwindend gering, da pro Analyse nur wenige Nanoliter injiziert werden, mit dem Nachteil, dass trotz Isotachophorese nur maximal 30% der Kapillare mit Probe gefüllt werden kann, entsprechend einem Volumen von ca. 200 nL. Eine hohe Probenkonzentration ist deshalb Voraussetzung für eine erfolgreiche Analyse. Um hier eine Verbesserung zu erreichen, müssen für die Zukunft Möglichkeiten gefunden werden, die ähnlich wie bei der Flüssigchromatographie, eine online Konzentrierung der Probe erlauben. Nichtsdestotrotz konnten wir zeigen, dass die Verbindung von Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie eine ideale Ergänzung zu konventionellen analytischen Methoden ist, die sowohl den Probendurchsatz als auch die Analysenqualität eines jeden Proteinanalytik-Labors steigern kann.

Zusammenfassung (Englisch)

Traditionally, LC-MS is the analytical technique of choice for proteomic analyses. However, it is well documented that protein and peptide analysis using LC-MS is not without challenges. To overcome these problems, while maintaining or even increasing sensitivity, efforts are going on to couple capillary electrophoresis, as an alternative separation technique, to mass spectrometry. In this context and in the course of this PhD thesis, we investigated in a novel sheathless interface that enables CE-MS coupling via a porous nanospray emitter tip.

Our first scientific results applying this novel interface was published in Analytical Chemistry in 2011. In this article, we describe how to optimize the electrospray voltage and the distance between emitter tip and mass analyzer to obtain a stable electrospray at low flow conditions of around 100nL/min. We tested three different capillary coatings for their use in peptide separation of medium complex samples and evaluated the reproducibility of signal intensity and migration time. Using optimized conditions we observed a remarkable high peptide signal intensity caused by extreme narrow peak shapes. This increase and the fact that multiple low molecular mass peptides were lost in LC-MS (they poorly interact with the reversed phase material) resulted in a higher number of peptide identifications when analyzing the same peptide samples with both CE-MS and LC-MS.

In the second manuscript published in Molecular & Cellular Proteomics (2013) we describe in detail the capabilities of CE-MS and LC-MS for the analysis of linker and core histones. Histones are small highly basic proteins occurring in all higher eukaryotes in multiple subtypes and are subjected to extensive post-translational modifications that are known to be significant for gene expression and DNA repair. Both the complexity and unique physical and chemical property of this protein family is a challenging task requiring the most advanced separation techniques. Using CE- and LC-MS in a complementary manner, we were able to map plenty of known and also several unknown modification sites when analyzing enzymatically digested histones (bottom-up proteomics). In contrast, when analyzing intact histones (top-down proteomics), CE-MS was able to separate differentially acetylated histone variants to provide a rapid overview of the core histones acetylation and methylation status.

In the third part, the ability of CE-MS was investigated to characterize and quantify proteins, peptides and phosphopeptides present in a highly complex sample, the proteome of yeast. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) was used for relative quantification of two yeast proteomes. Protein extracts of these two strains were mixed and enzymatically digested. The resulting peptides were pre-separated by RP-HPLC and analyzed by CE-MS. CE-MS analysis was performed using a neutrally coated capillary, a capillary that ensured highest separation efficiency at real low flow conditions (10 nL/min). These real low flow conditions in combination with the novel sheathless interface provided highest sensitivity and yielded a considerably increased number of quantified and identified proteins when compared to a gel based LC-MS approach. The variability in peptide heavy/light ratios was significantly reduced which was especially important for quantification of low abundant proteins and phosphopeptides. The work presented here shows the first quantitative phosphoproteomic approach that combines a SILAC experiment with CE-MS separation.

To conclude, coupling of capillary electrophoresis and mass spectrometry via the novel sheathless interface has proven to be a valuable tool in proteomics. CE-MS allows for high sensitive analysis and precise quantification of analytes. Analysis time can be adapted (via different capillary coatings and background electrolytes) according to the complexity of the sample or to the respective analytical question. Traces of sample carryover can be washed out in just a few minutes; the system is fully automated so that multiple samples can be analyzed sequentially; and the sample consume per analysis is in the low nano-liter range. However, the low sample consume can also be considered as a drawback. Despite the fact that the sample load can be increased by applying isotachophoresis, the analyte concentration should be rather high to ensure successful CE-MS analysis. Therefore, the implementation of an online sample pre-concentration technique, such as applied in LC-MS, will be a prerequisite for the widespread application of CE-MS. Nevertheless, CE-MS has proven to complement standard analytical techniques in a perfect manner and allows to increase sample throughput and analysis sensitivity in proteomics laboratories

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