Titelaufnahme

Titel
Characterization of proteins and their posttranslational modifications by top-down mass spectrometry / by Barbara Storch
VerfasserStorch, Barbara
Betreuer / BetreuerinBreuker, Kathrin
Erschienen2014
Umfang144 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Enth. u.a. 1 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2011 . - Zsfassung in dt. Sprache
Datum der AbgabeSeptember 2014
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Massenspektrometrie (MS) / Top-down / Protein / Elektrospray Ionisation (ESI) / posttranslationale Modifikation (PTM) / Elektronen-Einfang Dissoziation (ECD) / Disulfidbrücke
Schlagwörter (EN)mass spectrometry (MS) / top-down / protein / electrospray ionization (ESI) / posttranslational modification (PTM) / electron capture dissociation (ECD) / disulfide bond
Schlagwörter (GND)Proteine / Posttranslationale Änderung / Massenspektrometrie / Elektrospray-Ionisation
Zugriffsbeschränkung
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Zu den posttranslationalen Modifikationen (PTMs) von Proteinen zählen alle chemischen Veränderungen, die nach der Proteinbiosynthese am Ribosom stattfinden. In den letzten Jahren wurde erkannt, dass sie eine große Bedeutung für die Faltung, Wechselwirkungen, Stabilität und Aktivität von Proteinen sowie deren Verteilung in der Zelle spielen. Da alle bekannten PTMs die Masse des Proteins verändern sind massenspektrometrische (MS) Methoden ideal um den Typ, die Stelle und das Ausmaß der Modifikation zu untersuchen. Die derzeit am häufigsten verwendeten Studien nutzen den ‘bottom-up MS Ansatz, bei dem das Protein vor der massenspektrometrischen Analyse chemisch oder enzymatisch in kleinere Peptide verdaut wird. Dieser Ansatz eignet sich gut um Proteine zu identifizieren, hat aber den Nachteil, dass Korrelationen zwischen einzelnen Modifikationen durch den Verdau verloren gehen können. Beim ‘top-down Ansatz hingegen wird zuerst das intakte Protein im Massenspektrometer analysiert, was sofort Information über die Heterogenität der Probe sowie mögliche Modifikationen liefert. In einem weiteren Schritt können einzelne Proteoformen im Massenspektrometer isoliert und mit etablierten oder neuen unimolekularen Dissoziationsmethoden wie Kollisionsanregung (CAD), Elektroneneinfang (ECD) oder Elektronenabspaltung (EDD) fragmentiert werden.

Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung neuer Methoden für die Charakterisierung von Proteinen und deren posttranslationaler Modifikationen mit top-down Massenspektrometrie von durch Elektrospray Ionisation (ESI) generierten Ionen. Die Forschungsfragen, die in dieser Arbeit behandelt wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

# Forschungsfragen

1 Wie wird die Ladungsverteilung von deprotonierten (M - nH)n- Protein- und RNA-Ionen durch ESI-Additive mit unterschiedlicher Gasphasenbasizität beeinflusst, und ist dadurch eine effiziente Manipulation der Ionen im negativen Ionisationsmodus möglich?

2 Wie kann Massenspektrometrie verwendet werden, um die Zahl und Konnektivität von Disulfidbrücken zu bestimmen?

3 Kann top-down Massenspektrometrie für die detaillierte Charakterisierung des heterogenen Proteins chicken MAX p14 verwendet werden?

4 Kann mittels top-down Massenspektrometrie zwischen Proteinisomeren unterschieden werden?

5 Welchen Einfluss haben typische Histonmodifikationen wie Methylierung, Acetylierung und Phosphorylierung auf die Ladungsverteilung von protonierten (M + nH)n+ Ionen bei der Ionisierung durch ESI?

6 Welchen Einfluss haben typische Histonmodifikationen auf die Dissoziation von (M + nH)n+ Ionen mit CAD und ECD?

Tabelle 1: Forschungsfragen, die in dieser Dissertation bearbeitet wurden.

Bei top-down Experimenten von durch ESI generierten mehrfach protonierten Ionen liefern ECD und CAD komplementäre Sequenzinformation. Azide Proteine und Ribonukleinsäuren (RNA) lassen sich jedoch weitaus besser im negativen ESI Ionisationsmodus ionisieren. Da die Ladung eine wichtige Rolle bei allen Dissoziationsmethoden spielt, ist eine effiziente Manipulation der negativen Ladung von großer Bedeutung. Eine umfassende Analyse verschiedener organischer Basen als Additive zu den Elektrospraylösungen und der Einfluss von ausgewählten Instrument-Parametern (Kapitel 2.1) zeigt, dass das Ausmaß der Ladung von Proteinen und RNA effizient beeinflusst werden kann. Da jedoch CAD und EDD von (M - nH)n- Ionen von Proteinen nur geringe Sequenzabdeckung liefert, liegt der größte Fokus dieser Dissertation (Kapitel 2.2 bis 2.4) auf der Charakterisierung von verschieden posttranslationalen Modifikationen durch Analyse von (M + nH)n+ Ionen und der Fragmentierung durch die im positiven Ionisationsmodus etablierten Dissoziationsmethoden CAD und ECD.

Die erste posttranslationale Modifikation, die im Detail untersucht wurde ist die Disulfidbrücke (Kapitel 2.2). Zuerst wurde eine neue Methode zum Bestimmen der Konnektivität der Disulfidbrücken mittels CAD entwickelt und dieser an drei verschiedenen Proteinen mit unterschiedlich komplexen Disulfidbrückenmustern getestet. Für die Proteine mit relativ einfachen Mustern, NTD und Trypsin Inhibitor, lieferte diese Methode wichtige Informationen über die Konnektivität der Disulfidbrücken. Bei den für CAD von Aprotinin benötigten höheren Kollisionsenergien wurde die Aufklärung der Disulfidbrücken jedoch durch unerwünschtes Öffnen der Disulfidbrücken erschwert. Danach wurde die wichtige Frage, ob Dusulfidbrücken während der Dissoziation durch ECD gebrochen werden, untersucht. Es wurden eindeutige Hinweise für vollständig intakte Disulfidbrücken nach der Dissoziation durch ECD, auch für Proteine mit basischen Aminosäureseitenketten direkt neben den Disulfidbrücken, und nach mehrfachem Elektroneneinfang, beobachtet. Jedoch wurde bei Experimenten mit Proteinen mit einer hohen Dichte an zyklischen Regionen die Öffnung von Disulfidbrücken festgestellt. Diese widersprüchlichen Ergebnisse können auf der Basis von Primär- und Sekundär-Radikalreaktionen erklärt werden. Zusätzlich kann Vibrationsanregung der Ionen vor der Dissoziation durch ECD das Öffnen der Disulfidbrücken ermöglichen. Die komplexen Effekte von Vibrationsanregung und Sekundär-Radikalreaktionen machen es fast unmöglich vorherzusagen, ob und in welchem Ausmaß einzelne Disulfidbrücken eines Proteins während CAD oder ECD geöffnet werden.

ECD wurde auch in einem weiteren neuen top-down Ansatz zur relativen Quantifizierung ortsspezifischer Modifikationen verwendet. Als Modelsystem wurde das in E. coli exprimierte Protein chicken MAX p14, das ungewöhnliche Heterogenität zeigte, verwendet. Eine genaue Analyse der Ionenausbeuten von modifizierten und unmodifizierten durch ECD generierten Fragmentionen gab Auskunft über die Art, den Ort und das ortsspezifische Ausmaß der Modifikation (Kapitel 2.3). Statt einer posttranslationalen Modifikation handelte es sich bei diesem Protein um einen R->Q Aminosäureaustausch, der durch Verwendung des seltenen CGG Condons bei der Expression verursacht wurde. Mit dieser top-down Methode konnte das Ausmaß der Modifikation für jede Stelle auf 5% genau bestimmt werden.

Für die Charakterisierung von Proteoformen oder Proteinisomeren nimmt der oben genannte Ansatz an, dass Proteine mit verschiedenen Modifikationen das gleiche Verhalten bei der Ionisation und Dissoziation im Massenspektrometer zeigen, unabhängig von der Art der Modifikation. Um die Gültigkeit dieser Annahme systematisch zu untersuchen wurden Histonpeptide (Kapitel 2.4) analysiert. Histone gehören zu den höchstmodifizierten Proteinen, deren Modifikationen signifikante Änderungen der Seitenkettenpolarität und Hydrophobizität verursachen. Deshalb wurde im Speziellen der Einfluss von Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung auf die Ladungsverteilung der Ionen im ESI untersucht. Diese Experimente zeigten, dass die mittlere Ladung der Proteine durch die Gasphasenbasizität der Modifikation beeinflusst wird. Außerdem wurde in Dissoziationsexperimenten von durch ESI generierten Ionen definierter Mischungen von N-terminalen Histon H3 Peptidformen und -isomeren gezeigt, dass nur ECD, nicht jedoch CAD, in der Lage ist, die Zusammensetzung der Probenlösung korrekt wiederzugeben.

Zusammenfassung (Englisch)

Posttranslational modifications (PTMs) encompass any kind of chemical alterations of a protein after its biosynthesis at the ribosome. In recent years, the importance of PTMs for protein folding, binding, stability, activity, and their localization within different cell compartments has been recognized. Because all known PTMs alter the mass of a given protein, mass spectrometry (MS) based methods are highly useful for studying the types, sites, and extent of modifications. Most currently employed MS methods rely on the 'bottom-up' approach, in which the protein under study is chemically or enzymatically digested into smaller peptides prior to analysis by mass spectrometry. While the bottom-up approach is well suited for protein identification, it is far less useful for protein characterization because correlations between individual modifications can be lost during the digestion step. With the ‘top-down MS approach, on the other hand, the intact protein is first analyzed in the mass spectrometer, which immediately reveals information about sample heterogeneity and possible modifications. In a second step, individual proteoforms can be selected in the mass spectrometer and subjected to conventional or new methods for unimolecular dissociation, such as collisionally activated dissociation (CAD), electron capture dissociation (ECD), and electron detachment dissociation (EDD).

The aim of this dissertation was the development of new methodology for the characterization of proteins and their posttranslational modifications by top-down mass spectrometry of ions from electrospray ionization (ESI). The specific research questions addressed here are summarized in Table 1.

# Research Questions

1 How is protein and RNA (M - nH)n- ion charge affected by ESI solution additives of differing gas phase basicity, and can additives be used for efficient manipulation of ion charge in negative ion mode ESI?

2 How can mass spectrometry be used to determine the number and connectivity of disulfide bonds?

3 Can top-down MS be used for detailed characterization of the heterogeneous protein chicken MAX p14?

4 Can top-down MS distinguish between protein isomers?

5 What is the effect of typical histone modifications such as methylation, acetylation and phosphorylation on (M + nH)n+ ion net charge of peptides from ESI?

6 What is the effect of typical histone modifications on (M + nH)n+ ion dissociation by CAD and ECD?

Table 1: Research questions that are addressed in this dissertation.

ECD and CAD give complementary sequence information in top-down MS experiments using multiply protonated proteins from ESI. Acidic proteins and ribonucleic acids (RNA), however, can be ionized far more efficiently in ESI in negative ion mode. Because charge plays a critical role in directing fragmentation, efficient manipulation of negative ion net charge is highly important. A comprehensive study of organic bases as ESI solution additives and the effect of instrument parameters (Chapter 2.1) shows that the extent of charging of proteins and RNA in negative ion mode ESI can be controlled efficiently. Nevertheless, because CAD and EDD of (M - nH)n- protein ions provide only limited sequence coverage, the major focus of this thesis (Chapters 2.2 to 2.4) is the characterization of different types of posttranslational modifications using (M + nH)n+ ions in combination with the more established fragmentation techniques CAD and ECD.

The first type of posttranslational modification studied in detail is disulfide bonding (Chapter 2.2). First, a new approach for the determination of disulfide bond connectivity by CAD was developed and tested for three different proteins with differing complexity of disulfide bond patterns. For the proteins with relatively simple patterns, NTD and trypsin inhibitor, the CAD approach gave valuable information on disulfide bond connectivity. At the higher energies required for CAD of aprotinin, however, unintended opening of disulfide bonds upon vibrational excitation seriously interfered with this approach. Second, the important question of whether or not disulfide bonds are cleaved during ECD was addressed. Unambiguous evidence for full preservation of disulfide bonds during ECD was found even for proteins that have basic residues next to cysteine residues involved in disulfide bonding, and under conditions of multiple electron capture. However, for proteins with a high density of cyclic regions, disulfide bond cleavage during ECD was observed. These apparently contradictory findings were rationalized on the basis of primary and secondary radical reactions in ECD. Moreover, vibrational excitation prior to ECD can facilitate disulfide bond cleavage. The rather intricate effects of vibrational excitation and secondary radical reactions make it nearly impossible to predict whether or not, or to what extent, individual disulfide bonds in any given protein are preserved during CAD or ECD.

ECD was also used in a new top-down MS approach for the relative quantitation of site-specific modifications. As model system served the chicken MAX p14 protein from overexpression in E. coli, which showed unexpected heterogeneity. A thorough analysis of ion yields of modified and unmodified fragments from ECD of proteoforms and protein isomers gave information about the type, sites, and site-specific extent of modification (Chapter 2.3). Instead of a posttranslational modification, an R->Q amino acid substitution resulting from overexpression of rare CGG codons was discovered. With this top-down approach, the extent of modification for each site could be determined to within 5%.

For characterization of proteoforms or protein isomers, the approach for relative quantitation of modifications above assumes identical ionization and dissociation efficiency regardless of the chemical nature of the modification. To investigate the validity of this assumption more systematically, histone peptides were studied (Chapter 2.4). Histones are among the most highly modified proteins, and their modifications can introduce significant changes in side chain polarity and hydrophobicity. Specifically, the effect of acetylation, methylation, and phosphorylation on the charge distribution of peptide ions from ESI was studied. The experiments revealed that peptide average net charge is affected by the gas phase basicity of the modification present. Moreover, the fragmentation of ions from ESI of defined mixtures of N-terminal histone H3 peptide forms and isomers by CAD and ECD showed that only ECD, but not CAD, provides fragment ion yields whose ratios correctly reproduce their relative concentrations in solution.