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Title
LCMV-GP pseudotyped VSV for oncolytic virotherapy of ovarian cancer / by Catherine Dold
AuthorDold, Catherine
CensorBergmann, Michael ; Culig, Zoran
Thesis advisorHolm-von Laer, Dorothee
Published2014
Description141 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2014
Date of SubmissionAugust 2014
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Vesikuläres Stomatitis Virus / VSV / LCMV / Pseudotypisieren / Onkolytisches Virus / Ovarialkarzinom / Onkolytisch / Virotherapie / Mesenchymale Stammzellen / MSC / Trägerzellen / Ruxolitinib
Keywords (EN)vesicular stomatitis virus / VSV / pseudotyping / oncolytic virus / ovarian cancer / oncolytic / virotherapy / Mesenchymal stem cell / MSC / Carrier cell / Ruxolitinib
Keywords (GND)Eierstockkrebs / Onkolyse / Viren / Expressionsvektor
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Abstract (German)

Bis heute ist das Ovarialkarzinom eine der schlimmsten gynäkologischen Krankheiten. Aufgrund von fehlenden Screenings werden die meisten Patienten erst bei fortgeschrittener Krankheit diagnostiziert, wenn sich Metastasen im gesamten Peritoneum gebildet haben. Konventionelle Therapie, bestehend aus Operation und Chemotherapie, heilt meistens den Patienten nicht und letztendlich kommt es zu einem Rezidiv.

Ein sehr erfolgversprechendes Konzept ist die onkolytische Virotherapie. Verschiedene onkolytische Viren wurden für Ovarialkarzinom entwickelt, aber bis heute gibt es keinen signifikanten Überlebensvorteil in Patienten behandelt in klinischen Studien.

Das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) ist eines der am erfolgversprechendsten onkolytischen Viren, aber die durch das VSV G Glycoprotein vermittelte Neurotoxizität hat bislang die klinische Anwendung dieses Virus limitiert. Die Gruppe „von Laer“ hat eine pseudotypisierte Version dieses Virus entwickelt, das rVSV(GP), wo das G Protein durch das GP Glycoprotein des Lymphozytären Choriomeningitis Virus ausgetauscht wurde (Muik et al., 2011). Der neue Pseudotyp war sicher in der Anwendung in immunokompetenten Mäusen und führte auch bei hohen Dosen nicht zu Neurotoxizität. In dieser Arbeit wurde rVSV(GP) für die Anwendung im Ovarialkarzinom untersucht. Das Virus wurde in einem „worst-case Scenario“ in immundefizienten Mäusen untersucht und war bis zu sehr hohen Titern anwendbar, auch in Tumor-erkrankten Mäusen.

Onkolytische Aktivität wurde in vitro untersucht in verschiedenen Ovarialkarzinom Zelllinien und das Virus konnte Zellen effizient infizieren und die meisten Zellen lysieren. In vivo wurde rVSV(GP) in einem subcutanen Ovarialkarzinom Xenograft Maus Modell untersucht, wobei die Zelllinie A2780 verwendet wurde. Behandlung führte zur Tumor Rückbildung, aber in den meisten Fällen wurde ein Rezidiv festgestellt. In einem orthotopischen Xenograft Maus Modell führten intraperitoneale Injektionen des Virus zu signifikant verlängerter Lebensdauer verglichen mit unbehandelten Tieren.

Analyse der Immunantwort der Ovarialkarzinomzellen zu rVSV(GP) zeigten, dass die Zellen auf das Virus mit Typ I Interferon Produktion reagierten und ein antivirales Milieu in den Zellen generiert wurde. Dieses führte wahrscheinlich zu der oftmals unzureichenden Heilung. Die Zellen schützen sich selbst und umliegende Zellen vor der Infektion und damit auch vor der Onkolyse durch rVSV(GP).

Es wurde eine Kombinationstherapie von rVSV(GP) mit dem JAK1/2 Inhibitor Ruxolitinib entwickelt und erfolgreich im Ovarialkarzinom getestet. Der Inhibitor verstärkte den onkolytischen Effekt. Das Medikament wirkt, indem es den Signalweg inhibiert, der durch Typ I Interferon induziert wird. Dadurch kann es verwendet werden um die antivirale Immunantwort zu inhibieren und die virale Replikation zu unterstützen.

Um zudem die Infiltration in den Tumor zu verbessern und um Tumorgewebe spezifischer anzugreifen, wurden Mesenchymale Stammzellen (MSC) als potentielle Trägerzellen getestet. Die Trägerzellen werden ex vivo mit rVSV(GP) infiziert und anschließend wandern sie zu den Tumorlesionen, wo sie weitere virale Partikel produzieren. MSC konnten leicht mit rVSV(GP) infiziert werden und unterstützten die Replikation des Virus. Allerdings führte die Infektion zum Absterben der Zellen. Aus diesem Grund wurden zwei Ansätze entwickelt, um die virale Replikation zu kontrollieren und damit das Lysieren der MSC zu verhindern. Zunächst wurde das antivirale Protein MxA unter Regulierung eines Tet-On Sytems exprimiert. Das sollte das Virus inhibieren. Die Expression von MxA führte jedoch zur vollständigen Inhibierung des Virus und die virale Replikation konnte nicht erneut starten nachdem MxA Expression gestoppt wurde.

Aus diesem Grund wurde ein zweiter Ansatz getestet, bei dem shRNA verwendet wurde, die verschiedene virale Proteine inhibierte. Hier wurde die virale Replikation allerdings nicht ausreichend inhibiert und rVSV(GP) nur temporär und unzureichend reguliert.

Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit rVSV(GP) als potentes Virus getestet um das Ovarialkarzinom zu behandeln. Verminderte Replikation des Virus aufgrund der innaten Immunantwort konnte durch Kombinationstherapie mit dem JAK1/2-Inhibitor Ruxolitinib verstärkt werden. Zusätzlich wurden MSC untersucht, ob sie geeignete Trägerzellen darstellen. Obwohl MSC die nötigen Vorraussetzungen erfüllen, müssen in Zukunft Strategien entwickelt werden, die Replikation des onkolytischen Virus zu inhibieren bis die Zellen das Zielgewebe erreicht haben.

Abstract (English)

Ovarian cancer remains one of the most severe gynecological diseases. Due to lack of screening methods, most patients present at advanced stages, when metastases have formed throughout the peritoneal cavity. First line therapy consisting of debulking surgery and chemotherapy usually fails to cure patients and eventually tumors relapse.

One very promising new treatment approach is the use of oncolytic virotherapy. Different oncolytic viruses have been developed for ovarian cancer, but until today, no significant survival benefit has been observed in clinical studies using these viruses for ovarian cancer. Vesicular stomatitis virus (VSV) is one of the most promising oncolytic viruses, but neurotoxicity mediated by the VSV G glycoprotein has so far limited clinical development of the virus. The group “von Laer” has thus developed a pseudotype version of the virus, rVSV(GP), where the G protein is exchanged for the GP glycoprotein of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV-GP) [Muik et al., 2011]. The newly created pseudotype was shown to be safe in immunocompetent mice as it did not lead to neurotoxic phenotypes, even at high doses.

In this thesis, rVSV(GP) was analyzed and optimized for its application in ovarian cancer. Here, the virus was tested in a worst-case scenario in immunodeficient mice and found to be safe in its application up to high titers also in tumor-bearing mice.

Oncolytic activity was assessed in vitro in a variety of ovarian cancer cell lines and found to efficiently infect and lyse most of the cell lines. In vivo, rVSV(GP) was tested in a subcutaneous ovarian cancer xenograft mouse model using the A2780 cell line. Treatment led to tumor remission, but in most cases relapse was observed. In an orthotopic xenograft mouse model, intraperitoneal injection of the virus led to significantly prolonged survival compared to untreated animals.

Analysis of the innate immune response of ovarian cancer cells to rVSV(GP) revealed IFN type I production and induction of an antiviral state of the cells as a potential mechanism leading to shortcomings in virotherapeutic treatment. Once infected by the virus, the cells responded by secretion of type I IFN which led to the protection of surrounding, uninfected cells by induction of interferon stimulated genes, like MxA. Consequently, rVSV(GP) was unable to lyse the protected cancer cells. A combination therapy of rVSV(GP) with the JAK1/2-inhibitor Ruxolitinib was successfully tested and found to enhance the oncolytic effect. The drug inhibited the signalling pathway induced by type I IFN and could thus be used to inhibit the antiviral innate immune response and enable viral replication.

To increase infiltration of the tumor and to target tumor tissue more specifically, mesenchymal stem cells (MSC) were tested as carrier cells for rVSV(GP). The carrier cells were to be infected ex vivo with rVSV(GP) and migrate to the tumor nodules where they should produce viral progeny. MSC were easily infected by rVSV(GP) and supported viral replication efficiently. However, infection of MSC with the virus led to lysis of the cells. Two approaches were tested to control viral replication and thus prevent killing of the MSC. First, the antiviral protein MxA was conditionally expressed under Tet-On regulation. The expression of MxA, however, led to complete inhibition of the virus and there was no onset of viral replication once the expression of MxA was shut off. Thus, a second approach was tested, which consisted of shRNA targeting different proteins of the virus. Here, virus replication was not sufficiently inhibited and rVSV(GP) was only temporarily repressed.

In conclusion, rVSV(GP) was tested as a potent oncolytic virus to treat ovarian cancer. Restriction of viral replication due to the innate immune response could be overcome by the combination treatment of rVSV(GP) with the Jak-1/2 inhibitor Ruxolitinib. Furthermore, MSC were identified as potential carrier cells but strategies need to be developed to inhibit replication of the oncolytic virus until the cells have reached the target tissue.