Titelaufnahme

Titel
Lipocalin allergen uptake in human monocyte derived dendritic cells and functional consequences
VerfasserPosch, Beate
GutachterHeufler, Christine
Erschienen2017
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2017
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeFebruar 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Dendritische Zellen / Allergie / Lipocaline
Schlagwörter (EN)Dendritic cells / Allergy / Lipocalins
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-6285 Persistent Identifier (URN)
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Lipocalin allergen uptake in human monocyte derived dendritic cells and functional consequences [4.54 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Hintergrund: Bisher sind grundlegende Mechanismen, welche eine allergischen Th2 Immunantwort induzieren, unzureichend charakterisiert. Einige Studien zeigen jedoch, dass dendritische Zellen bei der Initiation allergischer Atemwegsreaktionen essentielle Faktoren darstellen, indem sie Aeroallergene aufnehmen und spezifische Stimuli für die Differenzierung von Th2 Zellen liefern. Ein Großteil der respiratorischen Säugetierallergene gehört zur Proteinfamilie der Lipocaline. Für unsere Studie verwendeten wir Lipocalin-Allergene, welche eine hohe Aminosäure Sequenzhomologie mit menschlichen Lipocalinen aufweisen. Wir arbeiteten mit dem Hunde-Allergen Can f 1 und dem homologen menschlichen Tränen-Lipocalin Lcn-1 sowie dem Katzen-Allergen Fel d 4 und dessen putativen menschlichen Homolog, das Major Urinary Protein (MUP). Die Ziele dieser Arbeit sind einerseits die Untersuchung der Interaktion zwischen humanen, aus Monozyten differenzierten dendritischen Zellen und den Lipocalinen und andererseits die Identifikation von Mechanismen, welche die Entstehung einer spezifischen allergischen Immunantwort induzieren.

Methoden: Es wurden Faktoren, welche die Differenzierung einer bestimmten Immunantwort bestimmen, wie die Antigenaufnahme, Reifungsinduktion, Tryptophan Abbau und die Zytokinproduktion dendritischer Zellen gemessen. Die Art der induzierten Immunantwort wurde durch die Messung spezifischer Indikator-Zytokine, IL-13 für Th2 und IFN- für Th1, in Ko-Kulturen von Lipocalin-behandelten dendritischen Zellen und allogenen, naiven T-Zellen verifiziert. Darüber hinaus wurde eine Genexpressionsuntersuchung von Lcn-1 oder Can f 1 behandelten dendritischen Zellen mit anschließender Reactome Pathway Analyse durchgeführt. Um die spezifischen Mechanismen der Lipocalin-Prozessierung in dendritischen Zellen zu untersuchen, führten wir zielgerichtete Lipocalin-aufnahme Studien via CD205 (DEC-205) durch, analysierten die Rekrutierung regulatorischer Rab Proteine und den proteolytischen Lipocalin-Verdau durch Cathepsin S. Um zukünftig die intrazellulären Prozessierungswege der Lipocaline zu verfolgen, produzierten wir Allergen-spezifische Antikörper mittels der single B-cell cloning Methode. Weiters stellten wir Hybrid-Lipocaline zur Identifikation allergenspezifischer Faktoren in Lipocalinen her und analysierten deren immunologisches Potential.

Resultate: Die Allergene Can f 1 und Fel d 4 lösten eine signifikant geringere Produktion Th1-induzierender Differenzierungsfaktoren wie die Expression von Reifungsmarkern, Tryptophan Abbau oder IL-12 Produktion in dendritischen Zellen aus, als die endogenen, nicht-allergenen Lipocaline Lcn-1 oder MUP. Infolgedessen exprimietren T-Zellen, welche mit Can f 1 oder MUP behandelten dendritischen Zellen ko-kultiviert wurden vermehrt das Th2 Indikator Zytokin IL-13 und geringere Mengen des Th1 Indikator Zytokins IFN-. Durch Microarray Analysen wurden die funktionellen Daten verifiziert. Zusätzlich zeigten diese eine differentielle Regulation der Gene, welche intrazelluläre Transport-, Sortierungs- und Antigenpräsentationswege regulieren. Aufgrund dieser Daten konzentrierten wir uns auf die Untersuchung der Prozessierungswege von Lipocalinen in dendritischen Zellen. Diese zeigten, dass Lipocalin-Allergene und deren nicht-allergene Homologe unterschiedlich von Cathepsin S prozessiert wurden. Die zielgerichtete Allergenaufnahme über DEC-205 und die Rab-Rekrutierungs Analysen erbrachten keine definitiven Ergebnisse. Wir produzierten allergen-spezifische Antikörper, welche in zukünftigen Experimenten dazu dienen werden, die intrazellulären Prozessierungswege der Lipocaline nachzuverfolgen. Durch unsere Analysen mit den Hybrid-Lipocalinen konnten wir das allergische Potential der Lipocaline möglicherweise auf zwei konservierte Aminosäuren einschränken.

Conclusio: Die Resultate dieser Doktorarbeit zeigen, dass humane dendritische Zellen in der Lage sind, je nach allergenem Potential homologer Lipocaline, eine spezifische Immunantwort zu induzieren. Allergene und nicht-allergene Lipocaline werden hierbei unterschiedlich von den dendritischen Zellen prozessiert, was einen Einfluss auf die Differenzierung der Immunantwort zur Folge haben könnte. Das allergene Potential von Lipocalin-Allergenen könnte somit auf zwei Aminosäuren eingrenzt werden. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass lediglich die Interaktion von dendritischen Zellen und Lipcoalinen ausreicht, um die spezifische Differenzierung einer Immunantwort zu induzieren.

Zusammenfassung (Englisch)

Background: Dendritic cells (DCs) are one of the key players during the induction of allergic airway inflammation in providing stimuli for Th2 cell differentiation. However, the underlying mechanisms driving the initiation of Th2 mediated allergic immune responses still remain to be solved. Most of the major mammal derived respiratory allergens belong to the lipocalin protein family. For our study we employed allergens with a high sequence homology to endogenous human lipocalins. We specifically used the dog allergen Can f 1 and its human non-allergenic homologue Lipocalin-1 (Lcn-1) as well as the cat allergen Fel d 4 and its putative human homologue the major urinary protein (MUP). This thesis aims to investigate the interaction of human monocyte derived DCs with lipocalins and to identify the underlying mechanisms directing the type of immune responses.

Methods: We established an in vitro model to analyze the interaction between DCs and lipocalins. Factors involved in directing the type of immune responses including antigen uptake, maturation induction, tryptophan breakdown and cytokine production by human monocyte derived DCs were determined. The kind of induced immune response was verified in DCallogeneic T cell co-cultures measuring key cytokine secretion of T cells. A microarray of dendritic cells treated with the lipocalins (Lcn-1 or Can f 1) and a subsequent global gene expression reactome pathway analysis were performed. To define differential processing mechanisms of lipocalins in DCs, regulatory Rab protein recruitment analyses, lipocalin proteolysis via cathepsin S and site directed uptake analyses via CD205 (DEC-205) were analyzed. Allergen specific antibodies were produced via the single B-cell cloning approach for future lipocalin tracking experiments. To identify lipocalin intrinsic features responsible for their allergenicity, hybrid-lipocalins were produced and immunologically tested.

Results: The homologous lipocalins had differential effects on DCs according to their allergenic potential. The allergens Can f 1 and Fel d 4 persistently induced less of the Th1 skewing maturation marker expression, tryptophan breakdown and IL-12 production in human monocyte derived DCs when compared to the endogenous non-allergenic Lcn-1 or MUP. As a consequence, T cells stimulated by DCs treated with Can f 1 or Fel d 4 produced more of the Th2 signature cytokine IL-13 and less of the Th1 signature cytokine IFN- than T cells stimulated by Lcn-1 or MUP treated DCs.

Microarray data supported our functional analyses and additionally revealed differences in the intracellular trafficking, sorting and antigen presentation pathways of allergen or non-allergen treated DCs. These data led us to focus on lipocalin processing in DCs. We found that lipocalin allergens and homologous non-allergens were divergently processed by cathepsin S. The site directed uptake of allergens via DEC-205 might induce a conversion to tolerance or remain allergic. Rab recruitment analyses revealed no differences between allergens and non-allergens. To track the processing pathway of the allergens in future experiments we isolated, produced and verified allergen specific antibodies form allergic donors via the single B-cell cloning approach. Hybrid-lipocalin analyses revealed two conserved allergen AAs as potentially decisive factors for lipocalin allergenicity.

Conclusion: This thesis demonstrates, that human monocyte derived DCs orchestrate immune responses in responding differentially to two pairs of highly homologous lipocalins according to their allergenic potential. Allergens and non-allergenic lipocalins are divergently processed in DCs, which might influence the direction of immune responses. The allergenic potential of allergen lipocalins might be confined to two AAs, highlighting hybrid-lipocalins lacking the allergen AAs as potential immunotherpeutical agents. In summary, the crosstalk of DCs with lipocalins alone has the potential to direct the type of induced immune response.