Titelaufnahme

Titel
The DHPR calcium current in mammalian skeletal muscle -vestigiality or exaptation for calcium homeostasis
VerfasserSchrötter, Kai
Begutachter / BegutachterinObermair, Gerald ; Papadopoulos, Symeon
Betreuer / BetreuerinGrabner, Manfred
Erschienen2017
HochschulschriftInnsbruck, Univ., Diss., 2017
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeJanuar 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)L-typ Calciumkanal / Skeletmuskel / Stöhr / DHPR / Erregungs-kontraktions-Kopplung / Calcium Einstrom / Evolution / Schnelle und langsame Muskulatur / ncDHPR / nifedipine / verapamil / Ex-vivo Kontraktion
Schlagwörter (EN)L-Type calcium channel / Skeletal muscle / Sterlet / DHPR / Excitation-contraction coupling / Calcium influx / evolution / ncDHPR / fast and slow twitch muscles / nifedipine / verapamil / Ex-vivo contraction
Projekt-/ReportnummerFWF P-23229-B09
Projekt-/ReportnummerDK-W1101-B12
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-6252 Persistent Identifier (URN)
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The DHPR calcium current in mammalian skeletal muscle -vestigiality or exaptation for calcium homeostasis [9.42 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Erregungs-Kontraktion (EK) -Kopplung im Skeletmuskel von Vertebraten wird vom L-typ-Calciumkanal oder auch Dihydropyridine-Rezeptor (DHPR) initiiert. Der DHPR ist ein spannungsgesteuerter Ionenkanal, der nach einer Depolarisation der Zellmembran mit Hilfe einer mechanischen Kopplung den Ryanodin-Rezeptor (RyR) im sarkoplasmatischen Retikulum aktiviert. Diese Signalübermittlung zwischen den zwei Kanälen ist Ca2+ unabhängig. Dies steht im Kontrast zur kardialen EK-Kopplung in Vertebraten oder der skeletmuskulären EK-Kopplung in frühen Chordaten, die vollständig auf Ca2+ induzierter Ca2+ Freisetzung (CICF) basiert. Trotz der Ca2+ unabhängigen EK-Kopplung im Skeletmuskel von Säugetieren, kommt es bei Aktivierung zu einem kleinen, langsam aktivierenden Ca2+ Einstrom in das Myoplasma. Dieser Ca2+ Einstrom, der nicht (unmittelbar) für die Muskelkontraktion benötigt wird, fehlt vollkommen in höheren Teleostfischen wie z.B. Zebrafischen (Schredelseker et al., 2010). Die Rolle dieses Ca2+ Einstroms im Säugetierskeletmuskel ist auch noch nach über 40 Jahren intensiver Forschung unklar. Wie in dieser Arbeit ausgeführt, wollten wir die Hypothese testen, dass während der Evolution von Wirbeltieren der fehlende evolutionäre Druck in Post-CICR-Spezies zu einer progressiven Reduktion der skeletmuskulären DHPR-Ca2 + -Leitfähigkeit führte, bis sie vollständig verschwand (Schrötter/Dayal und Grabner, in press). Darüber hinaus, dass die beiden nicht-Ca2+-leitenden DHPR-Paraloge, die in Zebrafisch gefunden wurden, unterschiedliche und spezialisierte Eigenschaften aufweisen (Dayal et al., 2015). Und letztlich, dass der DHPR-Ca2+ -Strom im Skelettmuskel von Säugetieren vestigial ist (Dayal et al., submitted). Interessanterweise fanden wir, dass der frühe Strahlenflosser Stöhr (Acipenser ruthenus), wie Tetrapoden, nur eine skelettmuskuläre DHPR Isoform besitzen. Diese liegt phylogenetisch zwischen dem Ca2+ leitenden Säugetier DHPR (Kaninchen) und denen der höher entwickelten Euteleosten (Zebrafisch) (zf) DHPR, die vollständig die Ca2+ Leitfähigkeit verloren haben. Stöhr DHPR behielt noch seine Ca2+ Leitfähigkeit, aber die Ströme sind, im Vergleich zu Kaninchen, auf Grund von geringerer DHPR Membranexpression und verminderter Kanal Öffnungswahrscheinlichkeit (Po), deutlich reduziert. Bemerkenswert ist, dass Stöhre und Zebrafische die reduzierte Expressionsdichte mit erhöhter DHPR-RyR1 Kopplungseffizienz zumindest teilweise kompensieren. Ein einzigartiges Zebrafischmodell, das die Differenzierung zwischen schnellen und langsamen Myotuben mittels Fluoreszenz ermöglicht, gestattete es uns, ihre biophysikalischen Eigenschaften zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten eine höhere DHPR-Dichte in schnellen Myotuben im Vergleich zu langsamen Myotuben, aber es wurden keine Unterschiede in der halbmaximalen Aktivierungsspannung (V1/2) gefunden. Die Untersuchung der intrazellulären Ca2+-Freisetzung ergab, dass V1/2 von schnellen Myotuben Richtung mehr negativen Potentialen verschoben ist. Darüber hinaus zeigen langsame Myotuben eine erhöhte DHPR-RyR1-Kopplungswirksamkeit. Diese Eigenschaften scheinen DHPR-Isoform-intrinsisch zu sein, da dieselben Ergebnisse bei heterologer Expression der beiden klonierten zf DHPR-Paralogs (Schredelseker et al., 2010) in einer murinen DHPR-null-Muskelzelllinie gefunden wurden (Dayal et al., 2015). Die Punktmutation N617D, die in der Porenschleife II der Zebrafisch DHPR1S-b gefunden wurde, was ihre Nicht-Ca2+-Leitfähigkeit erklärt, wurde in das Maus-CACNA1S-Gen konstruiert, um die Rolle des DHPR-Ca2+ -Stroms von Säugern zu untersuchen. Eine Vielzahl von Studien über das resultierende ncDHPR-Mausmodell wurde durchgeführt (Dayal et al., submitted). In dieser Arbeit sind die Ergebnisse von Ex-vivo-Kontraktionsexperimenten dargestellt. Die untersuchten isometrischen Kontraktionseigenschaften von isolierten schnellen und langsamen Muskeln von jungen, erwachsenen und seneszenten ncDHPR-Mäusen unterscheiden sich nicht von ihrer Alterskontrolle. Zusätzlich konnten wir an isolierten Membranen unseres einzigartigen Mausmodells zeigen, dass DHPR Ca2+-Ströme von Säugetieren keine negativen inotropen Effekte aufweisen. Diese Ergebnisse lassen mehrere Schlussfolgerungen zu. Zunächst zeigen unsere Ergebnisse, dass die DHPR Ca2+ Leitfähigkeit auf dem phylogenetischen Weg von Tetrapoden zu Euteleosten langsam verringert wurde. Zweitens war für das abschließende „Abschalten“ der Ca2+ -Leitfähigkeit bei Euteleosten (Schrötter / Dayal und Grabner, Presse) das außerordentliche evolutionäre Ereignis der 3. Runde der teleostspezifischen Genomverdoppelung (Ts3R) erforderlich. Drittens erlaubte Ts3R die Entstehung von zwei noch spezialisierteren DHPR1S Paralogs in euteleost Fischen. Und schließlich bekräftigen unsere Ergebnisse die Hypothese, dass der verbleibende DHPR-Ca2+ -Einstrom in Tetrapoden nur ein evolutionärer Rest des alten Ca2+ -abhängigen EC-Kopplungsmechanismus ist (Dayal et al., submitted).

Zusammenfassung (Englisch)

Excitation-contraction (EC) coupling in vertebrate skeletal muscle is initiated by the L-type Ca2+ channel or dihydropyridine receptor (DHPR) that is responsible for sensing membrane depolarization, and then transduced via conformational coupling to the sarcoplasmic Ca2+ release channel ryanodine receptor (RyR1). This inter-channel signalling is Ca2+-influx-independent, which contrasts vertebrate cardiac-type or ancient skeletal muscle EC coupling of early chordates which are fully dependent on Ca2+ induced Ca2+ release (CICR). Nevertheless, during this EC coupling process in mammalian skeletal muscle, there is a slow Ca2+ current through the skeletal DHPR which is fully missing in euteleost fishes (Schredelseker et al., 2010). The role of this Ca2+ current, which is not (immediately) required for EC coupling, is even after more than 40 years of intense research still enigmatic. As presented in this thesis, we wanted to test the hypothesis that during evolution of vertebrates, the absent evolutionary pressure in post-CICR species lead to a progressive reduction of skeletal muscle DHPR Ca2+ conductivity until it fully vanished (Schrötter/Dayal and Grabner, in press). Furthermore, that the two non-calcium conducting DHPR paralogs found in zebrafish have distinct and specialized characteristics (Dayal et al., 2015). And ultimately, that the DHPR Ca2+ current in mammalian skeletal muscle is vestigial (Dayal et al., submitted). Interestingly, we found that the early ray-finned fish sterlet (Acipenser ruthenus) possess, like tetrapods, only one skeletal muscle DHPR isoform that is phylogenetically positioned between the Ca2+ conducting mammalian DHPR (rabbit) and the higher developed euteleost zebrafish (zf) DHPR, which completely lost Ca2+ conductivity. Sterlet DHPR still retained Ca2+ conductivity but the currents are, due to lower DHPR membrane expression and reduced channel open probability (Po), significantly reduced compared to rabbit. Remarkably, sterlet and zebrafish partially compensated reduced DHPR expression density by enhanced DHPR-RyR1 coupling efficacy. Likely, the emergence of two skeletal muscle DHPR paralogs, the complete loss of Ca2+ conductivity and Po in euteleost fishes, was based on the teleost-specific 3rd round of genome duplication (Ts3R). A unique zebrafish model, that allows differentiation between fast and slow myotubes by fluorescence, enabled us to study their biophysical characteristics. Our results revealed a higher DHPR density in fast myotubes compared to slow myotubes, but no differences in the half-maximum activation voltage (V1/2) was found. Investigating the intracellular Ca2+ release revealed that V1/2 of fast myotubes is shifted to more negative potentials. Moreover, slow myotubes show an increased DHPR-RyR1 coupling efficacy. These properties seem to be DHPR isoform-intrinsic, as the same results were found upon heterologous expression of the two cloned zf DHPR paralogs (Schredelseker et al., 2010) in a murine DHPR-null muscle cell line (Dayal et al., 2015). Point mutation N617D found in pore loop II of zebrafish DHPR1S-b, explaining its non-Ca2+-conductivity, was engineered into the mouse CACNA1S gene to investigate the role of mammalian DHPR Ca2+ current. A plethora of studies on the resulting ncDHPR mouse model was done (Dayal et al., submitted). Presented in this thesis are the results of ex-vivo contraction experiments. The investigated isometric contraction properties of isolated fast and slow twitch muscles of young, adult and senescent ncDHPR mice did not differ from their age matched wt control. Additionally, on isolated diaphragm of our unique mouse model we could show that mammalian DHPR Ca2+ currents have no negative inotropic effects. These findings allow several conclusions. First of all, our results suggest that DHPR Ca2+ conductivity on the phylogenetic trajectory of tetrapods to euteleosts was slowly diminished, therefore “fading out”. Secondly, the extraordinary evolutionary event of the 3rd round of teleost specific genome duplication (Ts3R) at the basis of the teleost branch was necessary for the final “switch off” of Ca2+ conductivity in euteleosts (Schrötter/Dayal and Grabner, in press). Third, Ts3R allowed the emergence of two even more specialised DHPR1S paralogs in euteleost fishes. And finally, our results support the hypothesis that the remaining DHPR Ca2+ influx in tetrapods is just an evolutionary remnant of the ancient Ca2+ dependent EC coupling mechanism (Dayal et al., submitted).