Titelaufnahme

Ziel: Ziel dieser Dissertation war es, die Funktionalität und die follikuläre Entwicklung in kryokonserviertem und wieder aufgetautem humanen Ovargewebe zu untersuchen. Zusätzlich sollten molekulare Mechanismen, die bei der Follikelrekrutierung eine Rolle spielen untersucht werden.

Methode: Zwei drei-Millimeter -große Stücke von kryokonserviertem und wieder aufgetautem humanen Ovargewebe von weiblichen Krebspatientinnen (n=11) wurden subkutan in den Nacken von sechs Wochen alten ovarektomierten SCID Mäusen (n=33) für vier (n=18) und 12 (n=15) Wochen xenotransplantiert. Am Ende des Beobachtungszeitraumes wurden die Transplantate entnommen und histomorphologisch und immunohistochemisch mit dem Proliferationsmarker KI67 analysiert. Apoptose wurde mittels TUNEL-Färbung bestimmt. Die PTEN Genexpression nach Xenotransplantation wurde mit qPCR, die PTEN Proteinexpression immunhistochemisch untersucht. Die endokrine Funktion des Ovars wurde mittels ELISA eruiert. Als Kontrolle wurde Gewebe direkt nach dem Auftauen ohne anschließende Xenotransplantation verwendet. P-Werte < 0,05 waren statistisch signifikant.

Resultat: 32 von 33 Mäusen haben den Beobachtungszeitraum überlebt. Die Transplantatswiedergewinnungsrate war 95.58% (65 von 68 Transplantaten). Der Prozentsatz an Primordialfollikeln nach vier (P<0,001) und 12 Wochen (P=0,009) Xenotransplantation war signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe. Der Prozentsatz an sekundären Follikeln war signifikant höher nach vier (P=0,018) und nach 12 Wochen (P=0,001) Xenotransplantation als in der Kontrollgruppe. Nach vier und 12 Wochen Xenotransplantation konnten signifikant mehr proliferierende Follikel als in der Kontrollgruppe (P<0,001) mittels KI67-Färbung detektiert werden. Mittels TUNEL-Färbung konnte gezeigt werden, dass alle Follikel nach Xenotransplantation intakt waren. 4 Wochen nach Xenotransplantation war die Expression von PTEN um 2,47 -fach reduziert. Dieses Ergebnis war signifikant, wenn man 2-Ct analysierte (P=0,042).

Zusammenfassung: Die höhere Menge an wachsenden im Vergleich zu ruhenden Follikeln, die man nach Xenotransplantation beobachten kann, wird höchstwahrscheinlich durch eine verminderte Expression von PTEN mit einer anschließenden beschleunigten Follikelrekrutierung verursacht.

Objective: To evaluate the functionality and follicular development of cryopreserved/thawed human ovarian tissue, as well as to investigate the molecular mechanisms involved in follicular recruitment after xenotransplantation of human ovarian tissue in SCID mice.

Method: Two 3-mm-pieces of cryopreserved/thawed human ovarian tissue obtained from female cancer patients (n = 11) were xenotransplanted into a subcutaneous neck-pouch of 6-week-old ovarectomized SCID mice (n =33) for 4 (n = 18) and 12 (n = 15) weeks. At the end of the observation periods, grafts were recovered and processed for histomorphological analysis as well as for immunohistochemical detection of the proliferation marker Ki67. Apoptosis was evaluated with TUNEL staining. PTEN gene expression level after xenotransplantation was determined with qPCR and PTEN protein expression level was determined by immunohistochemical staining. Endocrine ovarian function was proven by ELISA. Tissue directly after thawing served as pregraft control. P-values < 0.05 were considered as statistically significant.

Result: Thirty-two out of 33 mice survived the entire observation periods. Graft recovery rate was 95.58% (65 of 68 grafts). The percentages of primordial follicles after 4 weeks (P < 0.001) and 12 weeks (P = 0.009) of grafting were significantly lower in comparison to pregraft controls. The percentage of secondary follicle was significantly higher after 4 weeks of grafting (P = 0.018) and after 12 weeks (P = 0.001) of grafting in comparison to pregraft controls. Ki67 immunohistochemistry showed that proliferative follicles were significantly higher after 4 and 12 weeks of grafting compared to pregraft controls (P < 0.001). All follicles analyzed by TUNEL staining appeared healthy after xenotransplantation. The expression level of PTEN was reduced by 2.47-fold after 4 weeks of xenotransplantation and this result was significant when 2-Ct was analyzed (P = 0.042).

Conclusion: The higher proportion of growing follicles compared to resting follicles observed after xenotransplantation is most likely due to down-regulation of PTEN gene expression followed by acceleration of follicular recruitment.