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Titelaufnahme

Titel
Role of the DSL Family on cell-cell interaction in pulmonary inflammation
VerfasserWatzinger, Kathrin
Begutachter / BegutachterinMarschang, Peter ; Kwapiszewska, Grazyna
GutachterKähler, Christian
Erschienen2016
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2016
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeJuli 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Notch Signalweg / Inflammation / Monozyten / Dendritische Zellen / Pulmonal arterielle Hypertonie
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-5475 Persistent Identifier (URN)
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Role of the DSL Family on cell-cell interaction in pulmonary inflammation [2.59 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der Notch Signalweg ist ein höchst konserviertes System, welcher für die Embryonalentwicklung nötig ist, aber auch die Gewebehomöostase und Morphogenese von Stammzellen reguliert. Es ist bereits bekannt, dass das Notch Signalsystem in physiologischen Prozessen wie Lungenkrebs und PAH involviert ist. Wie erst kürzlich gezeigt wurde, besteht ein signifikanter Anstieg von perivaskulären Macrophagen und Monocyten bei PAH Patienten.

Humane Monozyten wurden aus EDTA antikoaguliertem venösen Blut von gesunden Spendern isoliert. Für den Migrationsassay wurden modifizierte 48-well mikrochemotaktische Kammern verwendet. Die Monozyten wanderten durch einen Nitrozellulosefilter [5 m] mit einer Inkubation von 45 min in einer humiden Atmosphäre (37 C und 5% CO2), hingegen wurde für DCs ein 8 m Filter verwendet und die Migrationszeit betrug 240 min. Die Zellen wanderten gegen einen Gradienten der zu testenden Substanzen (fMLP, JAG-1, DLL-4). Bei den Blockierungsexperimenten wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von DAPT und ADAM17 für unterschiedliche Zeiten inkubiert. Die Migrationstiefe im Filter wurde mikroskopisch ausgewertet. Dabei wurde die Distanz [m] von der Oberfläche vom Filter zu der untersten Ebene der Zellen gemessen. Die Daten wurden als „chemotaktischer Index“ dargestellt, welcher das Verhältnis zwischen der Migration des Chemoattractants und der des Mediums ist.

Alle vier Notch Liganden wurden sowohl auf mRNA als auch auf Proteineben auf beiden Zelltypen exprimiert. Die Notch Liganden JAG-1 und DLL-4 stimulieren signifikant die Migration, abhängig ihrer Konzentration mit einem maximalen Effekt bei [100 ng/ml]. Dieser Effekt war vergleichbar mit der maximalen Stimulation der bekannten Chemokine fMLP [10-8 M] und MCP-1 [10-8 M]. Interessanterweise wurde auch mit einer Präinkubation der Zellen von 30 min mit den Liganden eine maximale Wanderung bei einer Konzentration von [100 ng/ml] erreicht. Unterschiedliche Präinkubationszeiten mit den Liganden ergaben, dass eine Präinkubation von 30 min für eine Stimulation der Migration von Monozyten notwendig ist, aber bereits 15 min bei den DCs ausreichend waren. Eine signifikante Hemmung der Migration wurde durch eine Präinkubation mit dem - Secretase-Inhibitor DAPT erreicht und auch mit ADAM17 auf beiden Zelltypen erreicht. Mit DAPT-stimulierten Zellen konnte auch die Migration gegen verschiedene Zytokine erreicht werden, hingegen mit ADAM17 nur gegen die Notch Liganden und fMLP.

JAG-1 und DLL-4 simulieren direkt die Migration von humanen inflammatorischen Zellen in vitro. Es kann vermutet werden, dass JAG-1 und DLL-4 in erworbene und angeborene immunologische Prozesse in der PAH involviert sind. Folglich kann der Notch Signalweg als neues therapeutisches Target in der Zukunft dienen.

Zusammenfassung (Englisch)

The Notch signalling pathway is a well-conserved signalling system, involved in the embryonic development as well as in tissue homoeostasis and stem cell maintenance in adults. As known so far Notch signalling is engaged in physiological processes in lung cancer and pulmonary hypertension (PAH). As shown recently, a significant increase of perivascular numbers of macrophages (CD 68(+)) and monocytes (CD 14(+)) can be observed in PAH.

The aim of this study was to elucidate the role of the Notch signalling pathway in the migration of human monocytes and dendritic cells.

Human monocytes and DCs were isolated from venous blood, taken from healthy donors. For the chemotactic assays modified 48-well microchemotaxis chambers were used. Monocytes migrated through a 5 m pore sized cellulose membrane filter for 45 min in a humidified atmosphere against a gradient of the substances tested (fMLP, JAG-1, DLL-4). DCs migrated through an 8 m filter for 240 min in the same conditions as for monocytes. For blocking experiments cells were preincubated with specific inhibitors (DAPT and ADAM17) for different durations and with different concentrations. Migration depth of the cells was quantified microscopically by measuring the distance [m] from the surface of the filters to the leading front of the cells.

All four Notch receptors are expressed on mRNA as well as on protein level on monocytes and on DCS. The Notch ligands DLL-4 and JAG-1 significantly stimulated direct and indirect migration in a dose dependent manner revealing a maximal effect at [100 ng/ml]. The effect was comparable with the maximal stimulation elicited by the well-known chemoattractants fMLP [10-8 M] and MCP-1 [10-8 M]. Via checkerboard assay was shown, that monocytes and DCs migrate in a chemotactic and chemokinetic manner. Interestingly, at least 30 min of preincubation was necessary for monocytes to induce chemotaxis, but for DCs already 15 min were enough. Inhibition of migration was reached by preincubating cells with DAPT and ADAM 17 and migration against the Notch ligands. The inhibition is not caused by a cytotoxic effect of DAPT or ADAM 17. The migration of DAPT-stimulated cells toward different cytokines has been inhibited, but in contrast with ADAM17-primed cells no inhibition was visible.

JAG-1 and DLL-4 stimulated migration of human inflammatory cells in vitro. Thus, it can be expected, that JAG-1 and DLL-4 are involved in innate and adaptive immunological responses in PAH. Consequently, the Notch pathway may serve as a new therapeutic target in future.