Titelaufnahme

Titel
Aspects of chemically modified nucleosides in RNA solid-phase synthesis and NMR spectroscopy / eingereicht von Mag. rer. nat. Lukas Jud
VerfasserJud, Lukas
Begutachter / BegutachterinGrubmayr, Karl
GutachterMicura, Ronald
ErschienenInnsbruck, Juni 2016
Umfangxiv, 286 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftUniversität Innsbruck, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Kumulative Dissertation aus Acht Artikeln
Datum der AbgabeJuni 2016
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)RNA / RNA Festphasensynthese / Nukleoside Synthese / 19F-NMR Spektroskopie / Guanosin / Schutzgruppenstrategie / Boc / SCF3-Adenosin / SCF3-Guanosin
Schlagwörter (EN)RNA / RNA solid-phase synthesis / nucleoside synthesis / 19F-NMR spectroscopy / guanosine / protection group pattern / Boc / SCF3-adenosine / SCF3-guanosine
Schlagwörter (GND)RNS / Festphasentechnik / Fluor-19 / NMR-Spektroskopie / Schutzgruppe
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-4700 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Dokument ist ausschließlich in gedruckter Form in der Bibliothek vorhanden.
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

ursprüngliche Ansicht, dass eine RNA Sequenz einer einzigen, klar definierten Sekundärstruktur entspricht, wurde in den letzten Jahrzehnten weithin vom realistischeren Bild abgelöst, dass die biologische Funktion der RNA stark mit der Fähigkeit zusammenhängt ein ganzes Ensemble an unterschiedliche Strukturen einzunehmen. Obwohl es wohl-etablierte Techniken gibt, um statische Strukturen zu untersuchen, gibt es immer noch einen Mangel an praktikablen Methoden um strukturelle Veränderungen von RNA und vorübergehend, gering besetzte Zustände („angeregte Zustände“) oder dynamische Eigenschaften zu untersuchen. Um bessere Einblicke in biologische Prozesse zu bekommen, an denen RNA beteiligt ist, sind verbesserte Methoden um das dynamische Verhalten von RNA zu analysieren dringend notwendig.

Die Verwendung von NMR aktiven RNA Sonden, ist ein weit verbreiteter Ansatz um strukturelle Veränderungen von RNA oder dynamische Flexibilität von Biomolekülen zu untersuchen. Einige Studien mit 19F NMR Sonden wurden in der Vergangenheit sehr erfolgreich in unserem Labor durchgeführt. Fluor kommt nicht natürlich in RNA Molekülen vor, bietet jedoch mehrere Vorteile für die Verwendung in der NMR Spektroskopie, wie die 100% natürliche Häufigkeit des NMR aktiven 19F Isotops (Spin ), große Anisotropie der chemischen Verschiebung und Dispersion und enge Signale, wegen der schnellen transversalen Relaxation. Ein einzelnes Fluoratom in einem großen Biomolekül, resultiert jedoch oft in Sensitivitätsproblemen wie schlechtem Verhältnis von Signal zu Rauschen und breiten Signalen.

Um für dieses Problem einen Lösung anzubieten, wurde 2‘-deoxy-2‘-SCF3 Adenosin und 2‘-deoxy-2‘-SCF3 Guanosine synthetisiert, in Analogie zur Arbeit an 2‘-deoxy-2‘-SCF3 Uridin, publiziert von Fauster et al., 2012. Die SCF3-Gruppe stellt ein isolobales Spinsystem dar (keine Protonen Entkopplung notwendig), enthält drei chemisch äquivalente Fluoratome, was in einer Signalzunahme um den Faktor drei resultiert und einem einzigen scharfen Signal. Die erhaltenen Bausteine wurden in RNA eingebaut und ihre Fähigkeit RNA sekundär strukturellen Veränderungen zu untersuchen konnten gezeigt werden. Wenn die in RNA neue Funktionalität jedoch in einer doppelsträngigen Region positioniert wurde, führte das zu einer sehr ausgeprägten Destabilisierung des RNA Doppelstranges. Es wurde die Hypothese aufgestellt, die dann bestätigt werden konnte, dass das von der Verschiebung der Zucker Konformation von der in RNA natürlichen C2‘-endo zur C3‘-endo Konformation kommt, welche zu einer Störung der Wasserstoffbrückenbindung und des Basestackings führt.

Da Nukleosidmodifikationen die ein thermodynamisches Design des RNA Doppelstranges erlauben besonders für RNA interferenz (RNAi) Anwendungen erwünscht sind, wurde die SCF3-Gruppe in RNAi Experimenten am BASP1 Gen in Hühner DF1 Zellen angewandt (in Kollaboration mit Markus Hartl und Klaus Bister vom Institut für Biochemie, CMBI, Universität Innsbruck).

Zusätzlich soll erwähnt werden, dass für die Synthese von 2‘-deoxy-2‘-SCF3 Guanosine eine Schutzgruppenstrategie verwendet wurde, die auf der Arbeit von Simeone et al., 2011 basiert. Dadurch konnten typische Schwierigkeiten in der chemischen Synthese von Guanosinderivaten, wie schlechte Löslichkeit, hohe Polarität und lange mehrschrittige Prozeduren, die unweigerlich zu geringen Gesamtausbeuten führten vermieden werden.

Das führte zur Idee, dieses Schutzgruppenkonzept für die Guaninbase direkt in der RNA Festphasensynthese zu verwenden. Dafür wurden 2‘-geschützte (TBDMS, TOM) O6-tbu, N2-boc2 oder N2-Hboc Guanosinphosphoramiditbausteine synthetisiert und in einer ‚proof of principal‘ Studie verwendet.

Bereits die ersten Ergebnisse waren sehr vielversprechend und ermöglichten die Isolierung von RNA hoher Qualität und vollständig entschützt unter standard Entschützungs- und standard RNA Aufarbeitungsbedingungen.

Zusätzlich konnten die Vorteile des Konzepts für den chemischen Syntheseweg, durch die Synthese von 2‘-deoxy-2‘-SCF3, O6-tbu, N2-boc2 Guanosinphosphoramidit, 2‘-O-[(3-phthalimidopropoxy)methyl], O6-tbu, N2-Hboc Guanosinphosphoramidit und von 2‘-deoxy-2‘-azido, O6-tbu, N2-boc2 Guanosinphosphordiester Bausteins gezeigt werden. Trotzdem soll erwähnt werden, dass bei RNA die mit dem neuen Boc-Schutzgruppenkonzept synthetisiert wurden eine geringe Menge (3-8%) an tert-butyl-RNA Addukt beobachtet wurde, welche jedoch gut vom Hauptprodukt durch HPLC Anionenaustausch Chromatographie trennbar war. Meiner Meinung nach, wird dieser kleine Nachteil mehr als wettgemacht durch die Vorteile für die chemische Synthese der Guanosinderivate.

Basierend auf Fluorsonden, eine neuen 19F Carr-Purcell-Meiboom-Gill Relaxation Dispersions Methode wurde in Kollaboration mit Christoph Kreuz und Martin Tollinger entwickelt und untersucht, die eine neue Möglichkeit darstellt um RNA Dynamik zu bestimmen. Diese Methode erlaubt die präzise und genaue Messung von dynamischen Gleichgewichten und den Übergang zwischen unterschiedlichen Zuständen. Außerdem hilft es, Probleme die von klassischen CPMG Experimenten bekannt sind zu überwinden, wie Signalüberlappung, 13C13C skalare Kopplung und die besonders arbeitsintensive Probenpräparation in Kombination mit langen Messzeiten. Um einen Proton-entkoppelten 19F-NMR Sonde zu erhalten, wurde der 5-F,6-D Uridinphosphoramiditbaustein synthetisiert und an bestimmten Positionen in RNA eingebaut. Die Methode wurde an mehreren Beispielen in einer ‚proof of principal‘ Studie bestätigt und die klare Dateninterpretation, kurzen Messzeiten und hohe Genauigkeit wurde gezeigt.

Zusammenfassung (Englisch)

original view that one single RNA sequence corresponds to one single secondary structure was widely superseded in the past decades with the more realistic picture that the biological function of RNA is strongly connected with its ability to dynamically sample an entire ensemble of different structures. Although there are well established techniques to investigate static structures, there is still a lack of practicable methods to analyze RNA structural transitions, transiently, low populated states (so called excited states) or dynamic features. In order to get more profound insights into biological processes, in which RNA participates, improved methods to determine the dynamic behavior of RNA are urgently needed.

The application of NMR sensitive RNA probes is a widely used approach for the investigation of RNA structural rearrangement or dynamic flexibility of biomolecules. Some studies using 19F NMR probes were very successfully executed in our laboratory in the past. Fluorine, which is naturally not occurring in RNA molecules, offers numerous advantages for its use in NMR spectroscopy, like 100% abundance of the NMR active 19F isotope (spin ), high chemical shift anisotropy and dispersion, narrow signals due to fast transversal relaxation. A single fluorine atom in a large biomolecule, often results in sensitivity problems, like bad signal to noise ratio and broad signals.

In order to offer a solution to this problem, the 2'-deoxy-2'-SCF3 adenosine and 2'-deoxy-2'-SCF3 guanosine were synthesized, in analogy to work on uridine, published by Fauster et al., 2012. The SCF3 moiety constitutes an isolobal spin system (no proton decoupling necessary), containing three chemically equivalent fluorine atoms what results in a threefold intensity increase, and one single, sharp signal. The resulting building blocks were incorporated into RNA and their ability to investigate RNA secondary structure rearrangements could be demonstrated. However, if the novel moiety resided in a double stranded region, it led to profound destabilisation of the RNA duplex. It was hypothesized, and then affirmed, that this results from a shift of the sugar pucker from the in RNA naturally occurring C2-endo to the unusual C2-endo conformation, which led to disruption of hydrogen bonding and base stacking interactions.

Since nucleoside modifications, which allow a defined thermodynamic design of an RNA duplex, are highly desired for RNA interference (RNAi) applications and therefore, the 2-SCF3 modification was tested in RNAi experiments on the BASP1 gene in chicken DF1 cells (in collaboration with Markus Hartl and Klaus Bister, Institute for Biochemistry, CMBI, University of Innsbruck).

Additionally, it should be mentioned that in the 2'-deoxy-2'-SCF3 guanosine synthesis pathway a guanine nucleobase protection group pattern, based on work of Simeone et al., 2011, was applied. This allowed overcoming common difficulties of guanosine derivatives in chemical synthesis like bad solubility, high polarity, and long multistep procedures, which inevitably resulted in low overall yields.

This led to the idea to apply this guanosine base protection concept directly in RNA solid-phase synthesis. Therefore 2-protected (TBDMS, TOM) O6-tbu, N2-boc2 or N2-H(boc) guanosine phosphoramidite building blocks were synthesized to be applied in a prove of principal study.

Already the first results were found to be very promising, allowing the isolation of high quality, fully unprotected, crude RNA after standard RNA solid-phase synthesis and standard RNA processing.

Additionally, the benefits of the concept in the chemical synthetic pathway were illustrated by the successful synthesis of 2 modified guanosine derivatives, namely the 2'-deoxy-2'-SCF3 O6-tbu, N2-boc2 guanosine phosphoramidite, the 2-O-[(3-phthalimidopropoxy)methyl], O6-tbu, N2-H(boc) guanosine phosphoramidite and the 2-deoxy-2-N3, O6-tbu, N2-boc2 guanosine phosphodiester building block.

However, it should be mentioned, that the RNA synthesized with the novel boc-protected guanosine derivatives resulted in the formation of a minor amount (3-8%) of tert-butyl RNA adducts, which were well separable in HPLC anionic exchange chromatographic analysis. In my opinion this drawback is more than over-compensated by the benefits in the chemical synthesis of the guanosine derivatives.

Based on fluorine probes, a novel 19F based Carr-Purcell-Meiboom-Gill relaxation dispersion (CPMG RD) method was developed in collaboration with Christoph Kreutz and Martin Tollinger and investigated, which offers another possibility to determine RNA dynamics. This method enables precise and accurate measurements of dynamic equilibria and the interconversion of different states. Additionally it helps to overcome the problems of signal overlap, 13C13C scalar coupling and the highly laborious sample preparations combined with long experimental times, known from classical CPMG experiments on RNA. In order to provide a proton decoupled 19F-NMR probe, the 5-F,6-D uridine phosphoramidite building block was synthesized, and incorporated into RNA at distinct positions. The method was confirmed in a prove of principal study and the straight-forward data interpretation, short experimental times and high accuracy was demonstrated on a few examples.