Titelaufnahme

Titel
Charakterisierung der Bindemuster von Aquaporin-4 Autoantikörpern in Patienten mit Neuromyelitis Optica Spektrum Erkrankungen
VerfasserTuller, Friederike
Betreuer / BetreuerinReindl, Markus
Erschienen2016
HochschulschriftInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2016
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeMai 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Neuromyelitis optica Spektrum Erkrankungen / Aquaporin-4 / Autoimmunität / Autoantikörper / Epitop Spezifität / Durchflusszytometrie
Schlagwörter (EN)Neuromyelitis optica spectrum disorders / aquaporin-4 / autoimmunity / autoantibodies / epitope specificity / flow cytometry
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Neuromyelitis Optica (NMO) ist eine entzündlich-entmarkende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), welche lange Zeit als klinische Variante der Multiplen Sklerose (MS) betrachtet wurde. Mit der Identifizierung eines hochspezifischen Antikörpers, der sich gegen den Wasserkanal Aquaporin-4 (AQP4-IgG) richtet, grenzt sich die NMO und deren Spektrum Erkrankungen (NMOSE) heutzutage von MS ab. AQP4-IgG positive NMOSE werden als Antikörper-vermittelte Autoimmun Erkrankungen betrachtet, die zu einer entzündungs-vermittelten primären Astrozytopathie führen. In einem sekundären Prozess kommt es zur Zerstörung der Myelinscheide und Neuronen. Der AQP4 Wasserkanal wird auf den Endfüßchen der Astrozyten exprimiert und besteht aus sechs transmembranen Helices und drei extrazellulären Domänen A, C und E. Es konnte bereits gezeigt werden, dass definierte Aminosäuren (AS) in diesen Domänen kritisch für die Bindung der AQP4-IgG Antikörper sind. Die klinische Relevanz ist jedoch noch unklar. Das Ziel dieser Studie war die Charakterisierung der Epitop Spezifität von AQP4-IgG Antikörpern in seropositiven Patienten mit NMOSE. Für die quantitative Detektierung der AQP4-IgG Antikörper im Serum und der Zerebrospinalflüssigkeit (ZSF) haben wir eine hochspezifische und sensitive Zell-basierte Durchflusszytometrie Methode entwickelt. Hierbei wurden humane embryonale Nierenzellen transient mit einem EmGFP-markiertem AQP4 Wildtyp oder EmGFP-markiertem AQP4 Mutations Konstrukt transfiziert und die Bindung von insgesamt 84 positiven Serumproben von 39 Patienten analysiert. Wir haben dabei zwei definierte Bindemuster identifiziert die von unterschiedlichen Mutations Sensivitäten in den extrazellulären Domänen A und C abhängen. In dieser retrospektiven Studie konnten wir jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Bindemustern und klinischen bzw. demographischen Parametern oder dem Serumtiter feststellen. Interessanterweise haben wir jedoch in 10 von 18 Patienten, in denen wir Folgeseren analysiert haben, einen Wechsel im Bindemuster während des Krankheitsverlaufs feststellen können. Darüber hinaus haben wir unterschiedliche Bindemuster in einer gepaarten Serum/ZSF Probe eines Patienten gefunden. Dies könnte auf eine intrathekale AQP4-IgG Synthese hinweisen. Die klinische und diagnostische Relevanz dieser Analyse muss jedoch in einer großen prospektiven Multizentrischen Studie geprüft werden.

In einer zweiten Studie haben wir in einem in vitro Zellkultur Projekt die Differenzierung von AQP4-spezifischen B-Gedächtniszellen zu AQP4 sekretierenden Plasmazellen untersucht.

Dabei konnten wir in ersten Stimulationsversuchen mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes einer Gesundkontrolle eine Expansion des Plasmazell Kompartments, sowie leichte Erhöhung der Gesamt IgG Antikörper und Tetanus-spezifischen Antikörper erzielen. Bisher konnten wir jedoch keine erhöhte Anzahl von Antikörpern durch Stimulation von sortierten B-Zellpopulationen detektieren. Für zukünftige Studien der AQP4-spezifischen Plasmazell Differenzierung und AQP4-spezischen Antikörper Detektierung muss diese in vitro Zellkultur Methode weiter etabliert werden. Zudem haben wir das B-Gedächtniszell Kompartment von drei Patienten mit entzündlich-entmarkenden Erkrankungen des ZNS nach der initialen Rituximab Therapie analysiert und konnten eine klonal expandierte IgG B-Gedächtniszell Population, sowie erhöhte Serum BAFF Konzentrationen detektieren.

Zusammenfassung (Englisch)

Neuromyelitis Optica (NMO) is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS). The discovery of a highly specific antibody against the AQP4 water channel (AQP4-IgG) unified a spectrum of NMO related disorders (NMOSD) and distinguished them from multiple sclerosis (MS). AQP4-IgG positive NMOSD are considered to be antibody-mediated autoimmune diseases in which inflammation leads to a primary astrocytopathy with secondary destruction of the myelin sheath and neuronal loss. The AQP4 water channel is located on astrocytic end-feet processes and consists of six transmembrane helical domains and three extracellular loops A, C, and E in which defined amino acids (AA) were already proven to be critical for AQP4-IgG binding. However, the clinical relevance of these findings is unclear. The aim of this thesis was to characterize the epitope specificity of AQP4-IgG seropositive NMOSD patients. We established a highly specific and sensitive flow cytometry cell-based quantitative detection method for serum and cerebrospinal fluid (CSF) samples of NMOSD patients. We transiently transfected human embryonic kidney cells with either EmGFP-tagged AQP4 wild type (WT) or EmGFP-tagged AQP4 mutant constructs and compared a total of 84 positive serum samples from 39 NMOSD patients for their binding capability. Overall, we could identify two broad patterns of antibody recognition based on differential sensitivity to mutations in the extracellular loop A and C. However, we could not find significant differences between these two patterns regarding demographic and clinical parameters, or serum titers in this retrospective study. Interestingly, we found a change of AQP4-IgG epitope recognition pattern in 10/18 NMOSD patients with available follow-up samples. Moreover we found different binding patterns in a paired serum and CSF sample in one of our patients, indicating an intrathecal AQP4-IgG synthesis. This study demonstrates that AQP4-IgG in sera of NMOSD patients show distinct patterns of antibody recognition. The clinical and diagnostic relevance of these findings have to be addressed in prospective multicenter studies.

In a second project we focused on AQP4-specific memory B cells and their differentiation into AQP4 secreting plasma cells (PCs) in vitro. Preliminary results showed expanded PC compartments and slightly increasing numbers of total IgG and Tetanus-specific IgG antibodies after stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a healthy control (HC) donor. However, we could not detect increasing antibody levels after stimulation of separated B cell populations. Therefore, methodological improvement in B cell differentiation in vitro is required to detect AQP4-specific PCs and antibodies from NMOSD patients in future studies. Furthermore, we analyzed the memory B cell compartment of three patients with inflammatory CNS diseases after the initial rituximab treatment and detected clonally expanded IgG memory B cells and increased serum BAFF levels.