Titelaufnahme

Titel
Possibilities and limitations to detect and cultivate (non-extremophilic) Archaea and their ubiquitous distribution / of MMSc Christoph Reitschuler
VerfasserReitschuler, Christoph
GutachterIllmer, Paul
ErschienenInnsbruck, Mai 2016
Umfang168 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftUniversität Innsbruck, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in englischer Sprache
Kumulative Dissertation aus fünf Artikeln
Datum der AbgabeMai 2016
SpracheEnglisch ; Deutsch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Archaea
Schlagwörter (EN)Archaea
URNurn:nbn:at:at-ubi:1-5570 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Zusammenfassung (Deutsch)

Um zuverlässige Resultate mittels molekularer Methoden zu erhalten bedarf es einer zeitintensiven prä- und postanalytischen Evaluierung. Nichtsdestotrotz konnte in dieser Dissertation ein Layout optimierter und evaluierter molekularer Methoden entwickelt werden, welches erfolgreich zur Aufdeckung und Beschreibung von Archaea Gemeinschaften in unterschiedlichsten Habitaten eingesetzt werden konnte [Fragestellung I]. Die Anwendung kulturbasierter Methoden ist nicht weniger zeitintensiv, da die Wachstumsevaluierung und Screening Prozesse einer umfangreichen postanalytischen (zumeist DNA basierten) Auswertung bedürfen, insbesondere wenn wenig oder nichts über die Physiologie des betreffenden, bisher nicht-kultivierten Organismus bekannt ist. Dennoch gelang es nicht nur bereits beschriebene methanogene und Ammonium-oxidierende Archaea zu kultivieren, sondern auch die Anreicherung bis dato nicht charakterisierter Archaea (sogenannter Moonmilk Archaea), welche auf phylogenetischer Ebene einer völlig neuen Linie zuzuordnen sind [Fragestellung II). Die Kombination DNA-basierter und kulturtechnischer Methoden, in Verbindung mit diversen basisanalytischen Methoden wie GC und HPLC (Abb.4), machte es möglich, ein zuverlässiges und aussagekräftiges Gesamtbild von Archaea Gemeinschaften zu zeichnen.

Bei allen durchgeführten Untersuchungen war es extrem wichtig, Umweltproben steril und möglichst unverändert zu sammeln und aufzubewahren, um die natürliche mikrobielle Gemeinschaft nicht zu verändern und keine verfälschten Ergebnisse zu erzielen (Abb.4). Der molekulare DNA-basierte Ansatz, wie in Abbildung 4 (A) aufgezeigt, wurde umfassend evaluiert und im Wesentlichen bei allen Untersuchungsprojekten angewandt, auch wenn je nach Untersuchungsgebiet und Fragestellung spezifische Änderungen und Adaptierungen vorgenommen werden mussten. Die Ergebnisse zahlreicher Literaturrecherchen und Vorversuche führten dazu, eine mechanische Zellaufschlussmethode und DNA-Extraktionsvariante für die gesetzten Fragestellungen auszuwählen. Um Quantität und Qualität der so gewonnen DNA zu überprüfen, wurden fluoreszenz- und spektrophotometrische Methoden (Gelelektrophorese, NanoDrop und PicoGreen-basierte Analysen) angewandt. Umfassend evaluierte SYBR Green-basierte qPCR Analysen, mit NTCs, PCs und NCs zur Abschätzung von Spezifität und Sensitivität der Methodik, inklusive MCA Analysen, wurden weiters herangezogen um die mikrobiellen Gruppen der Archaea, Bakterien und Pilze zu quantifizieren. Ein spezieller Fokus wurde dabei auf Archaea und Bakterien gelegt, als auch auf die ökophysiologisch wichtigen Gruppen der methanogenen Archaea (MA) und der Ammonium-oxidierenden Archaea (AOA) (Abb.4 A). Die qPCR Methodik lieferte zwar primär quantitative phylogenetische Informationen bezüglich der Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften, aber auch Informationen hinsichtlich von Diversitäten und Veränderungen innerhalb von Gemeinschaften (s. MCA Analysen), als auch ökophysiologische Einblicke (s. Primer, konzipiert für funktionelle Gene). Um die Diversität der mikrobiellen Gruppen Archaea, Bakterien und Pilze zu analysieren und Veränderungen und Unterschiede zwischen Umweltproben aufzudecken, wurde die PCR-DGGE Analytik mit anschließender Cluster Analyse verwendet. Zusätzlich wurden die DGGE-DNA Banden auf (semi-)quantitativer Ebene analysiert, ausgeschnitten und sequenziert. Dadurch wurde der Informationsgehalt, welcher in den DGGE Analysen steckte, deutlich aufgewertet und es konnten zusätzlich qualitative und quantitative Daten hinsichtlich mikrobieller Gemeinschaften, bis auf Artniveau, erhoben werden (Abb.4 A). In speziellen Fällen wurden Klonbanken angelegt um längere DNA Fragmente zu generieren und präzisere Informationen bezüglich bestimmter Organismen zu gewinnen. Aufgrund der hohen Kosten von NGS Analysen zu Beginn dieser PhD Arbeit wurde diese Methodik in keinem der hier beschriebenen Projekte angewandt.

Bei Kultivierungsansätzen ist eine angemessene Probennahme und Lagerung äußerst wichtig, um keine artifiziellen Ergebnisse zu erzielen. Informationen aus Literatur und früheren Methodenevaluierungen wurden in die Konzeptionierung der Kultivierungsansätze miteinbezogen (Abb. 4 B). Nach einer zugrundeliegenden Medien- und Wachstums-Optimierungsphase folgte die Anreicherung von Archaea Spezies und Gemeinschaften in einer möglichst natürlichen Mischkultur mit anderen Mikroorganismen. Anschließend war es das Ziel, einzelne Spezies zu isolieren und in Reinkultur zu halten, um deren physiologische Bedürfnisse besser analysieren zu können. Im Allgemeinen sind kulturtechnische Bemühungen weit hinter jenen auf molekularbiologischer Ebene zurück, was hauptsächlich mit dem Erfolg von hochauflösenden Hochdurchsatz-Sequenziermethoden (wie etwa NGS) zu tun hat. Will man jedoch die ökophysiologische und globale Bedeutung von Archaea besser aufdecken bleibt es unumgänglich mehr Anstrengungen in die Kultivierung von bis dato als „nicht kultivierbar“ geltenden Arten zu stecken.

Der molekulare und der kulturtechnische Weg, so wie sie in Abbildung 4 präsentiert werden, dürfen jedoch nicht als getrennte und für sich separat stehende Möglichkeiten zur Erschließung von mikrobiellen und speziell von Archaea Gemeinschaften gesehen werden, sondern vielmehr als komplementäre Pfade um ein vollständigeres Bild zu generieren. Zusätzlich waren die Kulturansätze ein wichtiger Lieferant von Reinkulturen, welche als Referenzen und Standards für molekularbiologische Methoden herangezogen wurden (Abb.4 B). Die molekularbiologischen Methoden waren ihrerseits wiederum unumgänglich um die Kultivierungsansätze auszuwerten und den Informationsgehalt zu erhöhen (Abb.4 A). Standard Analysemethoden, wie etwa HPLC, GC, pH und TOC Analysen, wurden zusätzlich in die Untersuchungen implementiert um Standardumweltparameter zu erhalten und physiologische Gegebenheiten und Veränderungen aufzudecken (Abb.4, mittlerer Bereich).

Basierend auf den in dieser PhD Arbeit präsentierten Forschungsprojekten und der konstanten Detektion von Archaea in allen untersuchten Habitaten (Fig.5) und unter Berücksichtigung aktueller Publikationen anderer Forschungsgruppen, erscheint eine ubiquitäre Verbreitung von Archaea evident. In manchen Habitaten, wie etwa marinen Gewässern oder Moonmilk, sind Archaea anderen Mikroorganismengruppen sogar zahlenmäßig überlegen. Das wirft die Frage auf, ob die ökophysiologische Rolle und die globale Bedeutung von speziell nicht-extremophilen Archaea nicht neu evaluiert und interpretiert werden sollte und muss. Neue hochauflösende Detektionsmethoden in Kombination mit fortschrittlichen Kultivierungsstrategien werden in Zukunft sicherlich mehr Licht in die noch unentdeckte und weitestgehend nicht-kultivierbare Welt der Mikroorganismen bringen.

Auffallend ist die durchwegs niedrige Diversität von Archaea in einzelnen Habitaten, bei gleichzeitiger hoher Homogenität innerhalb eines bestimmten Ökosystems, eines Ortes oder über eine Saison hinweg (z.B. im Falle von Höhlen Bergmilch und alpinen Gewässern). Abgesehen davon waren die Abundanzen der Archaea als Ganzes und von einzelnen Gruppen hohen Schwankungen ausgesetzt. Während Archaea einen signifikanten Teil innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaften von Fermenter Systemen oder Moonmilk darstellen, scheinen sie nur einen geringen Teil innerhalb von alpinen Gewässern einzunehmen. Methanogene Archaea (Euryarchaeota) und Ammonium-oxidierende Archaea (Thaumarchaeota) waren jene beiden Archaea Gruppen welche eine nahezu allgegenwärtige Verbreitung in allen Untersuchungsobjekten aufzeigten (Abb.5). Man könnte diese beiden Gruppen deshalb auch als Generalisten innerhalb der Domäne Archaea bezeichnen. In bestimmten Habitaten, wie etwa in Höhlen Moonmilk, sind Ort- und Habitat-spezifische Archaea abundant, welche durch spezifischere physiologische Eigenschaften und Anpassungen gekennzeichnet sein dürften und demzufolge eher als Spezialisten anzusehen sind. Es ist sehr wahrscheinlich, dass auch in anderen Habitaten, wie Fermenter zur Bioabfallbehandlung und Biogasproduktion oder in Süßwasserhabitaten eine charakteristische Archaea Gemeinschaft indigen vorkommt (Abb.5), jedoch bis dato aufgrund von v.a. methodischen Limitierungen nicht oder nur unzureichend beschrieben werden konnte.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Archaea in allen untersuchten Habitaten und Umgebungen nachgewiesen werden konnten und eine wichtige Rolle in jedem einzelnen Umfeld zu spielen scheinen. Deshalb bedarf die unzureichend und unvollständig untersuchte Welt der Archaea hinsichtlich molekularer und kulturtechnischer Untersuchungen sicherlich verstärkter Forschungsanstrengungen.

Zusammenfassung (Englisch)

Molecular methods demand a time-intensive pre- and post-analytical evaluation in order to generate reliable data output. Nevertheless, an optimized and evaluated set of molecular tools was established and successfully applied to unravel and describe archaeal communities from different habitats in detail [research question I]. Cultivation attempts are even more time-consuming, with regards to the post-analytical growth evaluation and screening efforts, if the aim is to discover so-far uncultured organisms with unknown physiology. However, not only the cultivation of the well-studied MA and AOA was possible. Success was also achieved in enriching species from uncharacterized archaeal lineages (Moonmilk Archaea) [research question II]. In combination, the DNA-based molecular and the cultivation approach, with additional analytical support (Fig.4), made it possible to form a reliable and meaningful picture of archaeal communities, presented in this thesis.

In all research attempts the most important prerequisite was to collect environmental samples aseptically and in the most unaffected way, not to alter the native microbial community and cause artificial results (Fig.4). The molecular DNA-based approach, as outlined in figure 4 (A), was evaluated intensively and applied in all research projects with adaptions and alterations adjusted to each research area and with regards to the research questions. Literature research and pre-analytical evaluations led to the decision to apply a mechanical cell disintegration and DNA extraction method, with post-analytical checks regarding quantity and quality. Therefore, fluorescence- and spectrophotometrical methods (gel electrophoresis, NanoDrop and PicoGreen-based analyses) were chosen. Evaluated SYBR Green-based qPCR analyses, with NTCs, PCs and NCs to assess specificity and sensitivity of the assays, including MCA analyses, were applied to quantify the microbial domains Archaea, bacteria and fungi, with a special focus on archaeal and bacterial orders and genera and physiologically important groups like MA and AOA (Fig.4 A). Hence, qPCR provided primary quantitative phylogenetic data, but also information on diversities and alterations within microbial communities (see MCA analyses) and ecophysiological insights (see primer targeting functional genes). To analyze the diversity of the microbial domains Archaea, bacteria and fungi and to detect alterations and differences between different samples, PCR-DGGE analyses were applied, with subsequent cluster analyses. Furthermore, DNA bands were analyzed on a (semi-)quantitative basis and excised with subsequent sequencing analyses. Thus, the DGGE information content was upvalued significantly, providing quantitative-qualitative information on the microbial communities down to species level (Fig.4 A). In some special cases, clone libraries were constructed to obtain longer DNA fragments and more precise phylogenetic information on certain microorganisms. Due to the high costs of NGS analyses at the beginning of this PhD thesis NGS was omitted in all research projects.

The cultivation attempts also depend on appropriate sample taking and treatment. Information from literature and previous method evaluations were implemented in the design of the cultivation approaches (Fig.4 B). After a basic media and growth optimization phase, the main goal was to enrich Archaea in mixed culture with other microorganisms and afterwards to try to isolate certain species in pure culture and identify physiological characteristics if possible. So far the cultivation efforts are far behind molecular attempts, which is primarily attributable to the rise of high throughput sequencing technologies like NGS, amongst others. However, to reveal the ecophysiological and global impact of Archaea more efforts towards cultivation are necessary.

The molecular and cultivation strategies should not and cannot be regarded as separated paths to analyze microbial and, in particular, archaeal communities, but rather are connected and deliver a more complete community picture (Fig.4). Furthermore, cultivation attempts were important to obtain species as references and standards for molecular methods (Fig.4 B), while molecular methods were important to analyze the cultivation approaches and to increase the information output (Fig.4 A). Standard analytical tools, like HPLC, GC, pH, TOC analyses, were further implemented to obtain standard environmental parameters and to unravel physiological conditions and alterations (Fig.4, central part).

Based on current research and the constant detection of Archaea in every investigated habitat (Fig.5), including recent publications from other researchers, a ubiquitous distribution of Archaea is hardly deniable. In some environments (e.g. marine waters, moonmilk) archaeal abundances even outnumber other microorganisms, which raises the question whether the ecophysiological role and the global impact of especially non-extremophilic Archaea might have to be re-evaluated significantly. New high-resolution detection methods in combination with more sophisticated cultivation strategies will shed more light on the still unexplored and uncultured sphere of archaeal ‘Dark Matter.

One remarkable aspect is the relatively low diversity of archaeal species with a high homogeneity in a certain environment, location, or during a season (e.g. moonmilk, alpine freshwaters). However, archaeal abundances have always been subject to high fluctuations. While the archaeal community constitutes a dominant part within the investigated fermenter and moonmilk habitats, Archaea only play a minor role on a quantitative scale in freshwater communities. Methanogenic Archaea (Euryarchaeota) and ammonia-oxidizing Archaea (Thaumarchaeota) were those two archaeal groups that were almost constantly present in all research areas (Fig.5), and they are most probably the ‘most ubiquitous archaeal groups on Earth. Other habitats, like cave moonmilk, harbor typical moonmilk/subsurface Archaea, which might be of a more specialized ecophysiological character and specific for subsurface environments. It is likely that for other environments, like biowaste fermenters or freshwater systems, there is also a characteristic archaeal community present (Fig.5), although these are so far not or insufficiently described due to methodological limitations, amongst others.

In conclusion, Archaea could be proved constantly and seem to play a crucial part in each investigated environment. While the unexplored archaeal ‘Dark Matter needs further research efforts, both regarding molecular detection and cultivation attempts, a further unsolved and diffuse defined issue is whether a species or group of organisms should be addressed as non-extremophilic or extremophilic (Fig.5, grey area).