Titelaufnahme

Titel
FOXO3-mediated chemoresistance in high-stage neuroblastoma / by Dipl.ing (FH) Martina Rupp
Weitere Titel
Forkhead-Box-Protein O3 mediated chemoresistance in high-stage neuroblastoma
VerfasserRupp, Martina
Betreuer / BetreuerinAusserlechner, Michael
ErschienenInnsbruck, April 2016
UmfangGetrennte Zählung : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Innsbruck, Univ., Dissertation, 2016
Anmerkung
Kumulative Dissertation aus zwei Artikeln
Datum der AbgabeApril 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)FOXO3 / p53 / Neuroblastom / Zelltod / Chemoresistenz
Schlagwörter (EN)FOXO3 / p53 / neuroblastoma / cell death / chemoresistance
Schlagwörter (GND)Forkhead-Box-Proteine / Protein p53 / Neuroblastom / Zelltod / Arzneimittelresistenz / Tiermodell
Zugriffsbeschränkung
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Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

FOXO3 gehört zur Familie der Forkhead box O (FOXO) Transkriptionsfaktoren, welche aus vier Mitgliedern besteht: FOXO1 (FKHR), FOXO3 (FKHRL1), FOXO4 (AFX) und FOXO6. Die Aktivität von FOXO3 wird hauptsächlich durch posttranslationale Modifikationen oder durch die Interaktion mit anderen Proteinen reguliert. Phosphorylierung von FOXO3 durch die Proteinkinase B (PKB) führt zum Transport von FOXO3 aus dem Zellkern ins Zytoplasma, wo er dann inaktiv vorliegt. Im Neuroblastom (NB) kommt es durch die Überexpression von Neurotrophin Rezeptoren zu einer erhöhten Aktivität von PKB. In aggressiven Tumoren kann es jedoch vorkommen, dass trotz hoher PKB Aktivität FOXO3 im Zellkern vorliegt. Studien mit resistenten Brustkrebs- und Leukämiezelllinien haben gezeigt, dass FOXO3 Akkumulation im Zellkern die Aktivität des Phosphatidylinositol3-Kinase/PKB (PI3K/PKB) Signalweges erhöht und wesentlich zur Resistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum Doxorubicin beiträgt. Wir konnten erst kürzlich zeigen, dass in Biopsien von hochgradigen NB Patienten nach Chemotherapie eine von PKB phosphorylierte Form von FOXO3 im Zellkern lokalisiert ist, welche in weiterer Folge mit einer schlechten Überlebensrate korrelierte. Basierend auf diese Ergebnisse wurde in diesem Projekt untersucht, ob FOXO3 in sogenannten „high-stage“ NB Zelllinien zur Entwicklung von einem pro-apoptotischen zu einem „pro-survival“ Phänotyp beiträgt.

In der humanen NB15 Zelllinie wird Zelltod über die FOXO3-vermittelte Bim Induktion und in weiterer Folge durch erhöhte ROS Levels ausgelöst. Hingegen führt die Aktivierung von FOXO3 in den humanen NB4 und NB8 Zelllinien, sowie in der murinen NxS2 Zelllinie, nicht zum Zelltod, was auf eine fehlende Bim Induktion und fehlender ROS Akkumulation zurückzuführen ist. Mittels Chromatinimmunopräzipitation konnte gezeigt werden, dass FOXO3 an den BIM Promoter der „FOXO3-sensitiven“ NB15 Zellen bindet, diese Bindung jedoch in den „FOXO3-resistenten“ NB8 Zellen verhindert wird. In den resistenten NB4 und NB8 Zelllinien wird er Tumorsuppressor p53 funktionell exprimiert und akkumuliert nach Behandlung der Zellen mit Etoposid. In der sensitiven NB15 Zelllinie hingegen ist p53 nicht funktionell. Durch Sequenzierungsanalysen konnte festgestellt werden, dass die NB15 Zelllinie eine bis dahin noch nicht beschriebene Mutation in der DNA Bindedomäne von p53 aufweist, welche auch die Interaktion von FOXO3 mit p53 in Abhängigkeit von Stress verhindert. Im Gegensatz dazu, bindet FOXO3 an funktionelles p53 in den resistenten NB4 und NB8 Zelllinien und wird dadurch vom BIM Promoter ferngehalten. Des Weiteren, wirkt FOXO3 Aktivierung in diesen Zelllinien chemo-protektiv. Mittels Kockdown Studien konnte gezeigt werden, dass dabei die Induktion von Sestrin-3, einem detoxifizierendem Zielgen von FOXO3, bei der Entwicklung der Chemoresistenz eine wesentliche Rolle spielt.

Die Ergebnisse dieses Dissertationsprojektes beschreiben neue Mechanismen in der Inhibierung von FOXO3-induziertem Zelltod einerseits und andererseits die Rolle von FOXO3 in der Entwicklung von Chemoresistenz im NB mit Stadium IV.

Zusammenfassung (Englisch)

FOXO3 belongs to the mammalian family of forkhead box O (FOXO) transcription factors, which consists of four members, FOXO1 (FKHR), FOXO3 (FKHRL1), FOXO4 (AFX), and FOXO6. Activity of FOXO3 is mainly regulated by posttranslational modifications or by the interplay with other proteins. The regulation of FOXO3 by protein kinase B (PKB) phosphorylation is highly conserved from C. elegans to mammals and depends on growth factor signals of neurotrophic factors and their cognate tyrosine kinase receptors a signaling cascade often aberrantly expressed in the heterogenic human cancer neuroblastoma (NB). Hyper-active PKB leads to cytoplasmic sequestration of FOXO3 and transcriptional inactivation. Aggressive tumors however are present with an aberrant FOXO3 activity. Several studies in drug-resistant breast cancer and leukemia cell lines demonstrated a sustained nuclear FOXO3 accumulation causing upregulation of phosphatidylinositol3-kinase/PKB (PI3K/PKB) activity and development of doxorubicin resistance. We demonstrated recently that in NB patient biopsies post chemotherapy, a nuclear expressed and PKB-phosphorylated FOXO3 correlated with stage IV disease and poor clinical outcome. Based on these findings this project focuses on the question whether FOXO3 switches from a pro-apoptotic to a pro-survival phenotype in high-stage NB cell lines.

Activation of FOXO3 did not cause cell death in the human high-stage NB4 and NB8 cell lines as well as in the murine NxS2 cell line. This correlated with a lack of Bim induction by FOXO3. As a consequence ROS accumulation is also prevented in NB4 and NB8 cells whereas in NB15 cells ROS levels significantly increase upon FOXO3 activation. Chromatinimmunoprecipitation analyses reveal that FOXO3 does not bind to the BIM promoter region in “FOXO3-resistant” NB8 cell line compared to “FOXO3-sensitive” NB15 cell line. Immunoblot analyses show that the tumor suppressor protein p53 is transcriptionally active and accumulates after chemotherapy in the resistant NB4 and NB8 cells whereas in sensitive NB15 cells p53 is non-functional. Sequence comparisons of p53 expose a distinct mutation within the DNA binding domain of p53 in NB15 cells, which has not been described in the literature so far, and prevents binding of FOXO3 to p53 under genotoxic stress conditions. In contrast, functional p53 interacts with FOXO3 and thereby sequesters FOXO3 from the BIM promoter region in response to etoposide treatment.

In addition, activation of FOXO3 mediates resistance against chemotherapy in “FOXO3-resistant” NB4, NB8, and NxS2 cell lines. Knockdown studies demonstrated that the induction of pro-survival SESN3 by FOXO3 provides the additional trigger for the chemo-protective phenotype in NB4 and NB8 cells.

Taken together, this study describes novel mechanisms for the pro-survival and chemo-protective properties of FOXO3 in high-stage NB, which depend on the p53-mediated transcriptional activity of FOXO3.